草魚抗病毒轉基因P0代的構建和魚類Chordin基因的克隆及其對金魚尾型的影響.pdf

1、目前，魚類育種領域的一個重要方向是基因功能和轉基因研究。通過發(fā)掘重要性狀主效基因或其基因型，開展基因與性狀關聯(lián)分析或轉基因研究，從而選育出性狀優(yōu)良的新品種，有利于魚類的養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)不斷進步與發(fā)展。
　　為探索草魚抗出血病新技術，本研究采用衣殼蛋白靶向滅活（Capsid-targeted viral inactivation,CTVI）策略，利用Tgf2轉座子元件，構建了帶爪蟾EF1α和鯉熱休克蛋白70的2種不同啟動子的CTVI轉基因質(zhì)

2、粒 pTgf2-EF1α-VP3-SN和pTgf2-Hsp70-VP3-SN。該2種質(zhì)粒均含有草魚GCRV病毒衣殼蛋白VP3與金黃色葡萄球菌核酸酶(Staphylococcus nuclease,SN)融合表達閱讀框。通過將2種CTVI轉基因質(zhì)粒與體外合成的Tgf2轉座酶5'加帽 mRNA共同顯微注射入草魚1-2細胞期受精卵，獲得了帶2種不同啟動子的CTVI轉基因草魚群體。PCR和測序結果顯示，2種轉基因陽性草魚基因組中均含有外源GCR

3、V病毒衣殼蛋白VP3與金黃色葡萄球菌核酸酶SN基因片段，陽性率分別為40.2％和37.0%，表明Tgf2轉座子已成功介導CTVI融合表達基因整合到草魚基因組中。本研究共獲得了120尾P0代CTVI轉基因個體草魚，為將來構建抗出血病草魚新品系奠定了材料基礎。
　　本文還獲得了團頭魴Chordin基因cDNA的全長序列。團頭魴Chordin基因全長為3736bp，開放閱讀框為2829bp，可編碼942個氨基酸，其中包含18個氨基酸信號

4、肽和924個氨基酸成熟肽。與人類和斑馬魚一樣，團頭魴Chordin成熟多肽也包含2個結構域：CHRD和vWC結構域。團頭魴Chordin與人Chordin、金魚Chordin A/B和斑馬魚Chordin的序列相似度分別為68%、89%、88%和68%，由此可見團頭魴Chordin在進化上具有很強的保守性。RT-PCR分析結果表明，團頭魴Chordin基因在不同胚胎時期具有不同的表達模式，Chordin基因在0hpf至32hpf表達量較

5、為恒定，但是從36hpf階段，表達量呈逐漸降低的趨勢；在成魚團頭魴中，Chordin在除外其他組織中都有表達，在腦中的表達量最高。整胚原位雜交結果顯示，在團頭魴Chordin mRNA主要在胚胎的尾部表達，其中16pdf胚胎表達量較高。饑餓處理實驗結果表明，團頭魴Chordin mRNA在腦中的表達量呈急劇升高后降低然后又升高漸漸趨于穩(wěn)定的趨勢；注射生長激素處理實驗表明，團頭魴Chordin mRNA在腦中表達量隨著hGH注射劑量的升高

6、而呈逐漸降低的趨勢，通過對團頭魴Chordin基因的克隆和功能研究進一步為團頭魴良種的選育奠定了基礎。
　　此外，本論文進一步研究了Chordin基因與魚類尾型（單尾型-雙尾型）性狀的相關性。對于魚類尾鰭性狀決定因子的研究很少有報道，金魚作為我國重要的觀賞性經(jīng)濟魚類，其表型性狀尾鰭一直是人工選擇和培育的重要方向。金魚生長周期短，但是尾鰭性狀的變異率較大，難以達到大規(guī)模培育和養(yǎng)殖單一品種的要求。目前，已有研究表明Chordin A基

7、因的突變對金魚尾鰭骨骼系統(tǒng)形成、單尾或雙尾表型起著重要的作用。本研究采用分子生物學方法對不同品種金魚及其雜交魚進行了研究，發(fā)現(xiàn)Chordin A基因中含有一段18bp的特異堿基核苷酸序列第6為A突變?yōu)镚，16位G突變?yōu)門時，性狀表現(xiàn)為雙尾鰭，且表型為雙尾鰭的Chordin A基因型一定是雙尾純合位點。在多種魚中對這段特異堿基核苷酸序列對比分析可知，該序列具有較高的保守性。原位雜交對單、雙尾鰭的比較結果表明，Chordin A mRNA在

8、單尾鰭胚胎中表達量高于雙尾鰭，MyoD mRNA在單尾鰭胚胎中信號由背至尾逐漸減弱，而MyoG mRNA在雙尾鰭中信號由背至尾逐漸增強，Ntl mRNA在雙尾鰭胚胎中的尾部表達，Bmp4 mRNA在單、雙尾鰭胚胎中表達量都很高。通過CRISPR-Cas9系統(tǒng)對Chordin A基因的敲除實驗結果表明，Chordin A基因中的一個等位基因的突變，受另一等位基因的控制，實驗進一步驗證了金魚單、雙尾鰭的形成與卵質(zhì)內(nèi)Chordin A mRN