雞毒害艾美耳球蟲抗原NPmz19的免疫保護(hù)性研究.pdf

1、雞球蟲病給養(yǎng)禽業(yè)所帶來的經(jīng)濟(jì)損失極為嚴(yán)重。目前，應(yīng)用藥物防治遇到了球蟲耐藥性和藥物殘留的問題，大大限制了養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展，球蟲防治需要尋求新的途徑。實(shí)踐證明，激發(fā)宿主細(xì)胞免疫反應(yīng)來防治雞球蟲病是更有效的途徑之一。作為第三代疫苗的DNA疫苗的一個(gè)顯著優(yōu)勢(shì)是刺激機(jī)體產(chǎn)生廣泛的細(xì)胞免疫反應(yīng)和持久的免疫記憶，尤其應(yīng)用特定的球蟲保護(hù)性抗原聯(lián)合一些細(xì)胞因子，構(gòu)建調(diào)節(jié)型DNA疫苗，在球蟲病防治中具有不錯(cuò)的應(yīng)用前景。為此我選擇球蟲的抗原NPmz19基因與雞細(xì)

2、胞因子IFN-γ、IL-2基因，通過DNA重組技術(shù)分別構(gòu)建了真核重組質(zhì)粒pVAX1.0-NPmz19，pVAX1.0-NPmz19-IFN-γ、pVAX1.0-NPmz19-IL-2，進(jìn)行動(dòng)物免疫保護(hù)性試驗(yàn)比較這些真核重組質(zhì)粒的免疫保護(hù)效果。 根據(jù)GenBank上報(bào)道的NPmz19基因序列，利用計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)一對(duì)引物，從收集的E.necatrix裂殖子中提取總RNA，然后應(yīng)用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增出E.necatrix NPmz19基

3、因并對(duì)其進(jìn)行測(cè)序.測(cè)序結(jié)果表明，基因全長(zhǎng)960bP，比GenBank上報(bào)道的NPmz19基因序列少六個(gè)核苷酸，具有一個(gè)完整的開放閱讀框，編碼319個(gè)氛基酸，所得序列已提交到GenBank，登錄號(hào)為EU795423，與已知序列相比較，核苷酸和氨基酸同源性分別為94％和88％，51個(gè)堿基發(fā)生變異，24個(gè)氨基酸發(fā)生變異，但沒有變異成終止密碼子，NPmz19基因編碼約35KD的蛋白。 將上述克隆得到的NPmz19基因克隆到原核表達(dá)載體p

4、ET32a(+)中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET32a(+)-NPmz19，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌E.coli BL21中，通過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組NPmz19基因片段編碼的蛋白。SDS-PAGE電泳顯示，表達(dá)的重組蛋白分子量在35KD左右，且在誘導(dǎo)4-5小時(shí)后表達(dá)量最多。細(xì)菌經(jīng)超聲波裂解破碎，1％TritonX-100洗滌后，SDS-PAGE電泳顯示，pET32a(+)-NPmz19的表達(dá)產(chǎn)物絕大部分存在于包涵體中。包涵體經(jīng)過初步分離純化、變復(fù)性，再

5、經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，結(jié)果表明，純化的重組蛋白濃度為4.6mg/mL。 利用DNA重組技術(shù)，分別構(gòu)建pVAX1.0-NPmz19，pVAX1.0-NPmz19-IFN-γ、pVAX1.0-NPmz19-IL-2真核重組質(zhì)粒。酶切鑒定正確后，分別用重組質(zhì)粒免疫14日齡雞，1周后取注射部位肌肉組織，用RT-PCR，Western blot檢測(cè)抗原的表達(dá)情況。結(jié)果表明該NPmz19基因和細(xì)胞因子均能在注射部位肌肉中表達(dá)。 N

6、Pmz19重組蛋白、重組質(zhì)粒pVAX1.0-NPmz19，pVAX1.0-NPmz19-IFN-γ、pVAX1.0-NPmz19-IL-2經(jīng)腿部肌肉注射分別于14、21日齡兩次免疫小公雛。28日齡經(jīng)口接種新鮮的E. necatrix孢子化卵囊，一周后宰殺，然后分別作小腸病變計(jì)分、測(cè)定克盲腸內(nèi)容物卵囊數(shù)、增重、綜合抗球蟲指數(shù)(ACI)幾個(gè)指標(biāo)，確定其保護(hù)力的大小。結(jié)果表明，構(gòu)建的毒害艾美耳球蟲真核重組質(zhì)粒能有效地降低克盲腸內(nèi)容物卵囊數(shù)、減

7、少小腸病變和提高相對(duì)增重。pVAX1.0-NPmz19、pVAX1.0-NPmz19-IFN-γ、pVAX1.0-NPmz19-IL-2、NPmz19重組蛋白的克盲腸內(nèi)容物卵囊數(shù)平均值分別為1.04×105，0.93×105，0.65×105和1.56×105，小腸病變平均計(jì)分依次為1.03、0.97、0.69、1.53，相對(duì)增重率分別為91.18、93.78、96.61和85.56，綜合抗球蟲指數(shù)ACI分別是170.88、182.98