GADA、IA-2A微量平板放射結合檢測法的建立與臨床應用.pdf

1、背景： 1型糖尿病(T1DM)患者或前期個體血清中存在多種自身抗體，采用放射配體法(RLA)檢測谷氨酸脫羧酶抗體(GADA)和蛋白酪氨酸磷酸酶-2自身抗體(IA-2A)能正確指導T1DM分型與治療，同時也能有效預測TIDM的發(fā)生。然而RLA不易于自動化和不適應于大樣本的檢測，且檢測成本偏高，臨床應用受到限制。 目的： 建立GADA、IA-2A微量平板放射結合檢測法(RBA)，初步評價其臨床應用價值。嘗試采用該法檢

2、測末梢血中GADA和IA-2A，為今后應用于TIDM的篩查和預測提供基礎，并降低檢測成本。 方法： 1.方法建立采用重組人GAD65(或IA-2)質粒，經試管內轉錄與翻譯，獲得35S-GAD65抗原(35S-IA-2抗原)。經Sephadex G-25柱純化并稀釋的35S-GAD65抗原(35S-IA-2抗原)與2μl血清在V形底96孔平板中緩慢振蕩孵育24h，而后轉入已包被蛋白A的Millipore平板中。采用4℃ P

3、BS緩沖液洗滌抗原抗體復合物。并采用多功能液體閃爍發(fā)光儀計數，結果以WHO標準單位表示。 2.檢測條件優(yōu)化分析固定其他檢測條件不變，分別對標記抗原的純化方式、加入的放射性計數值、血清與標記抗原孵育時間、沉淀物洗滌次數和閃爍液型號的選擇進行優(yōu)化分析。 3.方法評價對方法的變異情況、重復性、線性與檢測限、回收率等進行評估；盲法檢測由美國疾病預防控制中心(CDC)提供的150例DASP 2005標本評價方法的靈敏度和特異性；評

4、價脂血、黃疸以及溶血對檢測結果的影響；評價其他自身免疫疾病(Graves病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風濕性關節(jié)炎等)對檢測結果的交叉反應；與經典RLA法比較，評價方法的一致性。 4.臨床應用檢N224例正常人GADA和IA-2A濃度，確定陽性閾值。并檢測162例TIDM和210例新診T2DM患者GADA和IA-2A濃度，評估臨床應用效果。 5.末梢血檢測對35例TIDM患者、24例T2DM患者和32例正常人同時采集靜脈血和手指

5、血，比較檢測結果的一致性。 6.成本分析對微量平板RBA法與經典RLA法檢測成本進行比較。 結果： 1.優(yōu)化的檢測條件包括采Sephadex G-25柱凝膠過濾層析法純化標記抗原，2μl血清與放射性計數為3×104標記抗原緩慢振蕩孵育24h，采用4℃PBS緩沖液洗滌沉淀物10次，以及采用OptiphaseSupermix型閃爍液進行放射性計數。 2.該法檢測GADA批內CV為3.8％～10.2％，批間CV

6、 5.6％～11.9％。檢測IA-2A批內CV為4.1％～10.0％，批間CV 5.7％～12.8％：間隔1月的3次重復檢測，GADA和IA-2A濃度差異無顯著性(P均>0.05)，所測標本陰、陽性結果判斷完全一致；WHO標準品濃度在15.63～250 IU/ml范圍內，血清樣品GADA在40.3～664 IU/ml，IA-2a在53-848 IU/ml范圍內線性良好。GADA檢測限為3.6IU/ml，IA-2A檢測限為0.54 IU/

7、ml；該法檢NGADA回收率為71.9％～122.8％，IA-2A回收率為72.0％-133.3％；DASP 2005結果顯示，檢測GADA靈敏度為78％，特異性為98％。檢測IA-2A靈敏度為72％，特異性為98％；血清標本TG濃度≤5.8mmol/L，TBIL濃度≤67.1μmol/L，血漿中Hb濃度≤5.3g/L下，對GADA和IA-2A檢測結果無顯著影響；交叉反應顯示，50例Graves病患者中GADA陽性2例，12例系統(tǒng)性紅斑

8、狼瘡患者GADA陽性1例，20例類風濕因子陽性的風濕性關節(jié)炎患者中GADA陽性1例。IA-2A在上述3種自身免疫性疾病中均未檢測出陽性；微量平板RBA檢測GADA與經典RLA法結果判定一致率97.5％，Kappa值0.95；檢測IA-2A與經典RLA法結果判定一致率96.5％，Kappa值0.92。 3.該法檢測GADA和IA-2A陽性閾值分別為40.0 IU/ml和9.2IU/ml(均為224例正常人的99％百分位點)；檢測T

9、1DM患者GADA陽性率為46.9％，明顯高于正常人的0.89％(P<0.001)。檢測T1DM患者IA-2A陽性率22.8％，也明顯高于正常人的0.89％(P<0.001)；檢測T2DM患者GADA陽性率為5.2％，顯著高于正常人的0.89％(P<0.01)。而IA-2A在T2DM患者中陽性率2.4％，與正常人相比，差異無顯著性(P>0.05)。 4.微量平板RBA法檢測手指血GADA與經典RLA法檢測靜脈血結果判定一致率96

10、.7％，Kappa值0.905。檢測IA-2A結果判定一致率100％；微量平板RBA法檢測手指血與靜脈血GADA和IA-2A結果判定一致率均為100％。 5.微量平板RBA法檢測單例抗體標本試劑成本為34.73元，較經典RLA法節(jié)約了成本19.69元。 結論： 建立的微量平板RBA法靈敏度、特異性、重復性好，與經典RLA法一致性高，臨床初步應用效果良好，能適用于末梢血的檢測，易于自動化且降低檢測成本，具有較好的臨