載脂蛋白A-I及其模擬肽D-4F對(duì)氣道炎癥及氣道高反應(yīng)性的作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、論文一 載脂蛋白A-I的基因缺失增加小鼠氣道反應(yīng)性,肺部炎癥和 膠原沉積的作用及機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究
　　 1.背景：載脂蛋白A-Ⅰ(apoA-Ⅰ),是高密度脂蛋白(HDL)的重要組成部分,其抗動(dòng)脈粥樣硬化作用已經(jīng)得到廣泛的承認(rèn),而且apoA-Ⅰ本身對(duì)器官和血管床也有保護(hù)作用。最近新的研究證據(jù)表明,HDL在肺臟中起著保護(hù)作用。與apoA-Ⅰ結(jié)合的ABCA-Ⅰ先前已經(jīng)被證明在維持脂質(zhì)組成、肺臟結(jié)構(gòu)和呼吸功能中起著重要的作用。最近,在蛋白

2、質(zhì)組學(xué)研究揭示純合子鐮刀細(xì)胞貧血病患者的血漿apoA-Ⅰ的水平合并肺動(dòng)脈高壓者總是比沒(méi)有合并肺動(dòng)脈高壓者低。另外有研究證實(shí),內(nèi)皮脂酶的基因缺失導(dǎo)致HDL水平升高2倍,并且增加了卵蛋白致敏的BALB/c小鼠的氣道高反應(yīng)性和肺部炎癥。盡管這些研究提供了這樣一個(gè)觀點(diǎn),那就是HDL有助于維持健康的肺臟,但是還沒(méi)有研究直接證實(shí)apoA-Ⅰ或者是apoA-Ⅰ的缺失對(duì)肺臟炎癥,血管舒張和氣道高反應(yīng)性的作用。 越來(lái)越多的證據(jù)表明,高水平的HDL并不總是

3、具有抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用。實(shí)際上,慢性炎癥狀態(tài)和氧化應(yīng)激已經(jīng)被證明能將HDL從具有抗炎和抗動(dòng)脈粥樣硬化作用的脂蛋白轉(zhuǎn)換成具有致炎性和致動(dòng)脈粥樣硬化作用的脂蛋白,從而使HDL失去有效的清除LDL,抗動(dòng)脈粥樣硬化和保護(hù)血管的功能。哮喘也能增加炎癥和氧化應(yīng)激。這些炎癥變化很可能解釋為什么成年女性中發(fā)作的哮喘和頸內(nèi)動(dòng)脈內(nèi)膜厚度的增加有顯著關(guān)系。 這些報(bào)告為我們提供了一個(gè)新的思想,那就是HDL對(duì)肺臟具有保護(hù)功能。但是目前還沒(méi)有任何研究表明,載脂蛋

4、白A-I是否直接決定或影響肺部炎癥及氣道高反應(yīng)性。 在這個(gè)報(bào)告中,我們研究了載脂蛋白A-I基因缺失對(duì)肺的炎癥,血管舒張反應(yīng),膠原沉積及氣道高反應(yīng)性的影響。我們的研究結(jié)果表明載脂蛋白A-Ⅰ對(duì)肺動(dòng)脈和氣道功能的維持具有保護(hù)功能，能有效的防止氣道的炎癥和膠原沉積。
　　 2.方法：
　　 2.1對(duì)血漿總膽固醇(TC)，HDL和致炎性HDL(p-HDL)的測(cè)定總膽固醇是由Wako公司生產(chǎn)的膽固醇氧化酶，酯酶試劑盒測(cè)定。HDL是用

5、Richmond公司生產(chǎn)的高密度脂蛋白膽固醇E試劑盒測(cè)定。致炎性HDL用MgCl2沉淀后和CuCl2孵化，加入熒光染料H2DCF后測(cè)定。
　　 2.2血漿(對(duì)氧磷酶)芳香酯酶活性的測(cè)定血漿芳香酯酶活性的測(cè)定是用苯乙酸作為底物進(jìn)行的。稀釋后的血漿被加到加到磷酸鹽緩沖液體系中(苯基乙酸[100 mmol/L]，氯化鈣[100 mmol/L]，pH值8.0)。苯乙酸的水解率由DU()640分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定。芳香酯酶的活性單位相當(dāng)于每

6、分鐘水解的每毫升中的苯乙酸的摩爾數(shù)。
　　 2.3肺泡灌洗液中亞硝酸鹽+硝酸鹽的定量測(cè)定肺泡灌洗液中亞硝酸鹽和硝酸鹽濃度使用臭氧發(fā)光法測(cè)定。30ul原液加到包含氯化碘的反應(yīng)體系中。一氧化氮的信號(hào)由一氧化氮分析儀測(cè)定。和標(biāo)準(zhǔn)硝酸鹽濃度曲線相比而得到原液中硝酸鹽和亞硝酸鹽的濃度。
　　 2.4血漿中3-NT的斑點(diǎn)雜交從小鼠體內(nèi)分離的血漿樣品直接點(diǎn)在硝酸纖維素膜上，晾干。膜用牛奶封閉，加一抗3-NT雜交，4℃過(guò)夜。第二天洗膜，

7、加二抗，ECL化學(xué)發(fā)光拍片來(lái)測(cè)定血漿中3.NT總的含量2.5 apoA-Ⅰ基因缺失對(duì)血管舒張的影響本實(shí)驗(yàn)全部采用小鼠的面部動(dòng)脈和肺動(dòng)脈血管，腹腔注射苯巴比妥后，分離小鼠的雙側(cè)的面部動(dòng)脈，其直徑一般在180-250um。血管兩側(cè)掛在微玻璃管上并連接60cm H2O的壓強(qiáng)。所有分離提取的所有血管均不作預(yù)處理。先測(cè)量最大血管內(nèi)徑(Vmax)，然后用U46619(10-9-10-8 mol/L)作預(yù)收縮并測(cè)值(V con)，然后依次用濃度梯度為

8、10-7-10-4moll L的乙酰膽堿(ACh)擴(kuò)張血管以測(cè)量在依次增加ACh濃度情況下的內(nèi)皮依賴的血管舒張情況(VACh)；按以下公式計(jì)算ACh擴(kuò)張血管的百分值：(VACh-Vcx/n)/(Vmax-Vcon}=血管擴(kuò)張率，以此血管擴(kuò)張率表示內(nèi)皮依賴的血管舒張情況。進(jìn)而用左旋硝基精氨酸甲酯(L-nitroarginiemethylester，L-NAME)和100umol/L預(yù)處理血管30 min，再重復(fù)用U46619和ACh處理血

9、竹以了解內(nèi)皮一氧化氮合酶(endothelial nitric oxidesynthase，eNOS)依賴的血管舒張功能。
　　 2.6脈沖振蕩技術(shù)測(cè)量氣道反應(yīng)性用Scireq2007小動(dòng)物肺功能分析儀通過(guò)強(qiáng)力脈沖振蕩技術(shù)來(lái)測(cè)定呼吸總阻(impedence，Zrs)，測(cè)定參數(shù)為中央氣道阻力(resistance，Rn)，外周氣道阻力(tissue damping，G)和組織彈性回縮力(tissue elastance，H)。

10、r>　　 2.7乙酰甲膽堿激發(fā)實(shí)驗(yàn)經(jīng)氣道濃度梯度增加應(yīng)用乙酰甲膽堿(3.125mg/ml～100mg/ml)激發(fā)氣道高反應(yīng)性。70ul乙酰甲膽堿在超聲霧化器中被霧化，然后經(jīng)由Scireq2007小動(dòng)物肺功能分析儀吸氣管道輸送至小鼠氣道。待曲線平穩(wěn)后進(jìn)行下一次給藥。在不同濃度的乙酰甲膽堿取得曲線，取其峰值，分別取得相應(yīng)的Rn，G和H值。
　　 2.8肺病理取材制片0.5毫升中性甲醛經(jīng)氣道灌洗管被緩緩注入肺中進(jìn)行組織固定。開胸摘取

11、肺，至于10％中性甲醛固定液中固定24h以上。常規(guī)石蠟包埋、制備石蠟切片、HE染色McLetchies三色染色來(lái)評(píng)估膠原沉積。
　　 2.9 BALF的分離和分析收回的肺泡灌洗液2000rpm離心后去除上清液，保存于-80℃。細(xì)胞沉淀懸浮于1 mlPBS，吸取500ul細(xì)胞懸液來(lái)制作細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞離心涂片，晾干后4％多聚甲醛固定，瑞氏染色，瑞氏染色后行光學(xué)顯微鏡下觀察500個(gè)細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞分類計(jì)數(shù)。
　　 2.10免疫熒光

12、測(cè)定肺病理切片中4HNE，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β-1(TGFβ-1)，3-NT和T-15的表達(dá)肺組織切片進(jìn)行脫蠟，梯度脫水，封閉，加一抗，加二抗，激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行免疫熒光測(cè)定。
　　 2.11 Western-blot分析黃嘌呤氧化酶(XO)，內(nèi)源性一氧化氮合酶(eNOS)和髓過(guò)氧化物酶(MPO)摘除小鼠肺組織，立即至于-80℃中凍存。研磨裂解肺組織，分離蛋白上清液。測(cè)定蛋白含量。SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，顯色，照相。

13、r>　　 2.12 BALF的氧化指數(shù)的測(cè)定氧化物H2DCF用來(lái)測(cè)定BALF中的氧化指數(shù)。75ul BALF與H2DCF混合(100μ L PBS+25μ L H2DCF和37℃孵育2小時(shí)。讀板器在2小時(shí)后讀取熒光值(Ex485nm；Em530nm)3.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：
　　 所有數(shù)據(jù)均用X±SEM表示，利用Prisme5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，指標(biāo)比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有顯著性。
　

14、　 4.結(jié)果：
　　 4.1 ApoA.I基因缺失對(duì)脂質(zhì)和氧化應(yīng)激的作用和C57BL/6J小鼠相比，apoA-Ⅰ-/-小鼠血漿中總膽固醇和HDL水平降低。盡管apoA-Ⅰ-/-小鼠含有的HDL水平低于C57BL/6J小鼠，但是其HDL的氧化速率要高于C57BL/6J小鼠，這也說(shuō)明apoA-Ⅰ-/-小鼠血漿中HDL是致炎性的。ApoA-Ⅰ-/-小鼠血漿中PON1的蛋白水平比C57BL/6J小鼠的高。但是，PON1的活性在apoA

15、-Ⅰ-/-小鼠血漿中比C57BL/6J小鼠降低了大約34％。和C57BL/6J小鼠相比，apoA-Ⅰ-/-小鼠血漿中硝酸鹽和亞硝酸鹽水平下降，血漿中3-NT的水平升高。
　　 4.2 ApoA-Ⅰ基因缺失對(duì)血管擴(kuò)張的作用分離的面部動(dòng)脈血管在預(yù)增壓后對(duì)Ach依賴的血管舒張反應(yīng)實(shí)驗(yàn)表明apoA-Ⅰ基因缺失對(duì)面部動(dòng)脈血管沒(méi)有影響。這些結(jié)果和之前的研究結(jié)果表明apoA-Ⅰ-/-小鼠對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化并不易感。然而，肺動(dòng)脈血管環(huán)的舒張反應(yīng)顯示

16、從apoA-Ⅰ-/-小鼠分離的血管環(huán)在最高濃度的Ach下舒張功能受損。從apoA-Ⅰ-/-小鼠分離的肺血管環(huán)在最高濃度的Ach下實(shí)際上表現(xiàn)出收縮反應(yīng)。相反地，從C57BL/6J小鼠分離的肺血管環(huán)在最高濃度的Ach下則表現(xiàn)出舒張反應(yīng)。ApoA-Ⅰ-/-小鼠肺動(dòng)脈血管的這些生理反應(yīng)的變化提示慢性炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激損傷了肺部血管的舒張。
　　 4.3 ApoA-Ⅰ基因缺失對(duì)氣道高反應(yīng)性的作用Flexivent動(dòng)物肺功能儀是對(duì)整個(gè)支氣管

17、呼吸動(dòng)力參數(shù)的測(cè)定。在主支氣管中，它測(cè)定中央氣道阻力(RN)，在外周支氣管中，它測(cè)定外周氣道阻力(G)和組織彈性回縮力(H)。經(jīng)MCh后，G(P<0.01)和H(P<0.001)在apoA-Ⅰ-/-小鼠中明顯升高，Rn在兩組中無(wú)明顯差別。在不同水平的氣道正壓通氣(PEEP)后，中央氣道阻力(RN)在兩組中無(wú)明顯差別。和C57BL/6J小鼠相比，apoA-Ⅰ-/-小鼠外周氣道阻力在基線水平(PEEP=0)升高(P<0.01)，并且在整個(gè)P

18、EEP曲線中，G在apoA-Ⅰ-/-小鼠比在C57BL/6J小鼠中高；在整個(gè)PEEP曲線中，組織彈性回縮力H在apoA-Ⅰ-/-小鼠中比在C57BU6J小鼠中升高(H，P<0.001)。
　　 4.4 ApoA-Ⅰ基因缺失對(duì)肺病理組織的作用肺組織病理HE切片顯示：與C57BL/6J系小鼠相比，apoA-Ⅰ-/-小鼠肺部血管和支氣管周圍炎癥細(xì)胞浸澗增多。盡管apoA-Ⅰ-/-小鼠肺部血管和支氣管周圍炎癥細(xì)胞比C57BL/6J系小鼠

19、增多2倍以上，但是肺浸潤(rùn)的白細(xì)胞數(shù)還沒(méi)有達(dá)到OVA致敏的C57BL/6J系小鼠的白細(xì)胞數(shù)(25-50細(xì)胞IJPHF)。ApoA-Ⅰ-/-小鼠肺組織切片顯示膠原沉積增多。與C57BL/6J系小鼠相比，apoA-Ⅰ-/-小鼠肺組織trichrome染色增強(qiáng)。BALF細(xì)胞涂片顯示BALF中主要含有肺泡巨噬細(xì)胞(>98％)。從apoA-Ⅰ-/-小鼠和C57BL/6J系小鼠的BALF的細(xì)胞圖片顯示apo A-Ⅰ的基因缺失對(duì)支氣管淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)沒(méi)有明

20、顯的作用。
　　 4.5 Apo A-Ⅰ的基因缺失對(duì)氧化應(yīng)激和炎癥生物標(biāo)記物的作用免疫熒光研究表明apoA-Ⅰ-/-小鼠的肺組織切片比對(duì)照組中3-硝基酪氨酸(3-NT)和4-羥基壬烯醛(4HNE)Michael加合物免疫熒光信號(hào)明顯增強(qiáng)。但是apoA-Ⅰ-/-小鼠的肺組織切片抗T15的自身抗體信號(hào)卻沒(méi)有比對(duì)照組升高。ApoA-Ⅰ的基因缺失導(dǎo)致呼吸道中4-HNE衍生的Michael反應(yīng)的加合物和活性TGF-β1表達(dá)增加。對(duì)照組C5

21、7BL/6J系小鼠相比，apoA-Ⅰ-/-小鼠肺組織中XO，MPO和eNOS的表達(dá)明顯升高。這些數(shù)據(jù)與硝酸鹽和亞硝酸鹽的數(shù)據(jù)相反，apoA-Ⅰ-/-小鼠的BALF中的硝酸鹽和亞硝酸鹽的水平比C57BL/6J系小鼠BALF硝酸鹽和亞硝酸鹽的水平下降。然而，與C57BL/6J系小鼠相比，，apoA-Ⅰ-/-小鼠的BALF中含有更多致氧化化合物。
　　 5.結(jié)論：
　　 1)ApoA-Ⅰ的缺失導(dǎo)致HDL在體內(nèi)的的保護(hù)作用消失，

22、并將HDL轉(zhuǎn)變成致炎性HDL，引起一系列氧化應(yīng)激反應(yīng)的加劇，導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化，eNOS解偶聯(lián)。
　　 2)ApoA-Ⅰ在預(yù)防肺部炎癥，受損的血管舒張及氣道高反應(yīng)性方面具有重要的保護(hù)作用。ApoA-Ⅰ及其相關(guān)的抗炎和抗動(dòng)脈粥樣硬化作用的缺失在血管功能和呼吸道生理功能方面具有深刻的和重要的影響。
　　 論文二ApoA-Ⅰ模擬肽,D-4F對(duì)apoA-Ⅰ和T-bet雙基因敲除小鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激和炎癥狀態(tài)的改善作用及機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究

23、r>　　 1.背景：高密度脂蛋白(HDL)在膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)和抗動(dòng)脈粥樣硬化和炎癥過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。越來(lái)越多的證據(jù)表明,高密度脂蛋白水平升高并不總是意味著對(duì)動(dòng)脈的保護(hù)。事實(shí)上,慢性炎癥和氧化應(yīng)激已被證明可將具有抗炎和抗動(dòng)脈粥樣硬化作用的HDL轉(zhuǎn)換成致炎性和致動(dòng)脈粥樣硬化性顆粒,使它失去對(duì)抗低密度脂蛋白(LDL),抗動(dòng)脈粥樣硬化和保護(hù)血管的作用。哮喘也增加炎癥和氧化應(yīng)激。在我們之前的研究中,我們發(fā)現(xiàn)載脂蛋白A-I在防止氣道高反應(yīng)和肺部

24、炎癥中具有重要的保護(hù)作用。 D-4F是載脂蛋白A-I的模擬肽,全部由D-氨基酸合成。D-4F有一個(gè)疏水螺旋可以結(jié)合脂質(zhì),這個(gè)與載脂蛋白A-I與脂質(zhì)的結(jié)合方式相似。D-4F對(duì)氧化的脂質(zhì)比普通脂質(zhì)具有更大的結(jié)合力,這個(gè)作用似乎與其對(duì)保護(hù)高密度脂蛋白的抗炎能力有關(guān)。在小鼠流感的模型中,D-4F被證實(shí)可以結(jié)合氧化脂質(zhì),重塑HDL,這種功能可能與其減少炎癥因子的產(chǎn)生有關(guān)。
　　 T-bet基因敲除小鼠,以自發(fā)地氣道高反應(yīng)性,肺部炎癥和氣道

25、重塑為特征。之前的研究發(fā)現(xiàn)apoA-Ⅰ基因缺失能增加小鼠的氣道高反應(yīng)性。為了研究高密度脂蛋白在氣道疾病中的作用,本實(shí)驗(yàn)將apoA-Ⅰ-/-小鼠和T-bet-/-小鼠進(jìn)行雜交,篩選出雙基因敲除的T-bet-/-/apoA-Ⅰ-/-小鼠有。為了進(jìn)一步驗(yàn)證D-4F能夠減少氣道疾病,實(shí)驗(yàn)中加用D-4F治療雙基因敲除的T-bet-/-/apoA-Ⅰ-/-小鼠。研究發(fā)現(xiàn),雙基因敲除的T-bet-/-/apoA-Ⅰ-/-小鼠有更高的氣道高反應(yīng)性,肺部

26、炎癥和膠原沉積。有趣的是,在T-bet-/-/apoA-Ⅰ-/-小鼠中,D-4F的治療降低了氣道高反應(yīng)性,減少肺部炎癥,膠原沉積。另外,D-4F的治療也減輕了T-bet-/-/apoA-Ⅰ-/-小鼠肺部的氧化應(yīng)激狀態(tài)。
　　 2.方法：
　　 2.1 T-bet-/-/apoA-Ⅰ-/-小鼠模型的篩選和建立 以C57BL/6J小鼠系的apoA-Ⅰ-/-小鼠和T-bet-/-小鼠均購(gòu)自美國(guó)杰克遜實(shí)驗(yàn)室,將其進(jìn)行雜交,產(chǎn)生T

27、-bet+/-apoA-Ⅰ+/-小鼠。將雜合子小鼠進(jìn)一步雜交,用PCR法篩選出雙基因敲除的T-bet-/-/apoA-Ⅰ-/-小鼠。T-bet-/-/apoA-Ⅰ-/-小鼠與對(duì)照組的T-bet-/-小鼠在出生體重上沒(méi)有明顯差別。10周左右時(shí),將雄性T-bet+/-/apoA-Ⅰ+/-小鼠隨機(jī)分成對(duì)兩組,一組每天腹腔注射PBS,治療組注射D-4F,(D-4F,AC-DWFKAFYDKVAEKFKEAF-NH2,3mg/kg體重),治療6周

28、。所有的動(dòng)物實(shí)驗(yàn),由威斯康星醫(yī)學(xué)院動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)(IACUC)批準(zhǔn)。 2.2對(duì)血漿總膽固醇(TC)和HDL的測(cè)定 總膽固醇是由Wako公司生產(chǎn)的膽固醇氧化酶/酯酶試劑盒測(cè)定。HDL是用Richmond公司生產(chǎn)的高密度脂蛋白膽固醇E試劑盒測(cè)定。
　　 2.3血漿(對(duì)氧磷酶)芳香酯酶活性的測(cè)定 血漿芳香酯酶活性的測(cè)定是用苯乙酸作為底物進(jìn)行的。稀釋后的血漿被加到加到磷酸鹽緩沖液體系中(苯基乙酸[100 mmol/L],氯化鈣[1

29、00 mmol/L],pH值8.0)。苯乙酸的水解率由DU(?)640分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定。芳香酯酶的活性單位相當(dāng)于每分鐘水解的每毫升中的苯乙酸的摩爾數(shù)。
　　 2.4肺泡灌洗液中亞硝酸鹽+硝酸鹽的定量測(cè)定 肺泡灌洗液中亞硝酸鹽和硝酸鹽濃度使用臭氧發(fā)光法測(cè)定。30ul原液加到包含氯化碘的反應(yīng)體系中。一氧化氮的信號(hào)由一氧化氮分析儀測(cè)定。和標(biāo)準(zhǔn)硝酸鹽濃度曲線相比而得到原液中硝酸鹽和亞硝酸鹽的濃度。
　　 2.5脈沖振蕩技術(shù)測(cè)量

30、氣道反應(yīng)性 用Scireq2007小動(dòng)物肺功能分析儀通過(guò)強(qiáng)力脈沖振蕩技術(shù)來(lái)測(cè)定呼吸總阻(impedence,Zrs),測(cè)定參數(shù)為中央氣道粘性阻力(resistance,Rn),外周氣道粘性阻力(tissue damping,G)和組織彈性回縮力(tissue elastance,H)。
　　 2.6乙酰甲膽堿激發(fā)實(shí)驗(yàn) 經(jīng)氣道濃度梯度增加應(yīng)用乙酰甲膽堿(3.125mg/ml～100mg/ml)激發(fā)氣道高反應(yīng)性。70ul乙酰甲膽堿在

31、超聲霧化器中被霧化,然后經(jīng)由Scireq2007小動(dòng)物肺功能分析儀吸氣管道輸送至小鼠氣道。待曲線平穩(wěn)后進(jìn)行下一次給藥。在不同濃度的乙酰甲膽堿取得曲線,取其峰值,分別取得相應(yīng)的Rn,G和H值。 2.7肺病理取材制片 常規(guī)石蠟包埋、制備石蠟切片、HE染色McLetchies三色染色來(lái)評(píng)估膠原沉積。
　　 2.8免疫熒光測(cè)定肺病理切片中4HNE,轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β-1(TGFβ-1) 常規(guī)脫蠟,梯度脫水,加一抗,加二抗,封閉組織切片 2.

32、9 Western-blot分析黃嘌呤氧化酶(XO)和髓過(guò)氧化物酶(MPO) SDS-PAGE電泳分離蛋白,轉(zhuǎn)膜,顯影,照相。 3.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)均用X±SEM表示,利用Prisme5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,指標(biāo)比較采用多因素方差分析,P0.05為差異有顯著性。
　　 4.結(jié)果:
　　 4.1血漿總膽固醇(TC),HDL的水平 注射PBS和D-4F的T-bet-/-/apoA-Ⅰ-/-小鼠血漿中總膽固醇(P0.001

33、)和高密度脂蛋白(P0.001)的水平比對(duì)照組T-bet-/-/apoA-Ⅰ+/+小鼠明顯降低。血漿中總膽固醇和高密度脂蛋白的水平在PBS注射組和D-4F組中無(wú)顯著性差異。
　　 4.2血漿中PON1的表達(dá)和活性 和對(duì)照組T-bet-/-/apoA-Ⅰ+/+小鼠相比,PBS組和D-4F組中T-bet-/-/apoA-Ⅰ-/-小鼠PON1的活性明顯下降(P0.001)。在T-bet-/-/apoA-Ⅰ-/-小鼠中,D-4F治療使P

34、ON1的活性有所升高,但沒(méi)有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 4.3肺泡灌洗液中硝酸鹽和亞硝酸鹽水平 肺泡灌洗液中硝酸鹽和亞硝酸鹽的水平提示體內(nèi)氣道中一氧化氮的產(chǎn)生。和對(duì)照組T-bet-/-/apoA-Ⅰ+/+小鼠相比,PBS組和D-4F組中T-bet-/-/apoA-Ⅰ-/-小鼠硝酸鹽和亞硝酸鹽水平明顯下降(P0.001)。在T-bet-/-/apoA-Ⅰ-/-小鼠中,D-4F治療使硝酸鹽和亞硝酸鹽水平的水平有所升高(P0.05)。 4.4 FIex

35、iVent動(dòng)物肺功能儀對(duì)呼吸力參數(shù)的測(cè) 乙酰甲膽堿激發(fā)實(shí)驗(yàn)中,中央氣道阻力和外周氣道阻力在三組中無(wú)明顯差異。組織彈性回縮力H(P0.05)在PBS組中的T-bet-/-/apoA-Ⅰ-/-小鼠比T-bet-/-/apoA-Ⅰ+/+對(duì)照組小鼠升高。
　　 4.5免疫熒光測(cè)定TGF-β1和4-HNE在肺組織的表達(dá)水平 在T-bet-/-/apoA-Ⅰ-/-小鼠中,經(jīng)D-4F治療后,TGF-β1 and 4-HNE在肺的含量明顯減少。

36、
　　 4.6肺組織病理學(xué) 和對(duì)照組T.bet-/-/apoA-Ⅰ+/+小鼠相比,PBS組的T-bet-/-/apoA-Ⅰ-/-小鼠肺部炎癥明顯增加,在氣管和血管旁的膠原沉積也增加。然而,經(jīng)D-4F治療的T-bet-/-/apoA-Ⅰ-/-小鼠肺中,肺部炎癥明顯減輕,膠原沉積也減少。
　　 4.7肺組織中XO的表達(dá) 與對(duì)照組T-bet-/-/apoA-Ⅰ+/+小鼠和PBS組T-bet-/-/apoA-Ⅰ-/-小鼠相比,D

37、-4F治療的T-bet-/-/apoA-Ⅰ-/-小鼠肺組織中黃嘌呤氧化酶(P0.05)的蛋白表達(dá)明顯增加。
　　 5.結(jié)論:1)總的來(lái)說(shuō),這些數(shù)據(jù)顯示在哮喘模型T-bet-/-小鼠基礎(chǔ)上,apoA-Ⅰ的缺失進(jìn)一步加重了肺部的炎癥和膠原沉積以及氣道高反應(yīng)性。這說(shuō)明apoA-Ⅰ在哮喘的發(fā)病中具有一定的保護(hù)作用。這一點(diǎn)也被apoA-Ⅰ模擬物D-4F的治療進(jìn)一步證明。經(jīng)D-4F治療后,T-bet-/-/apoA-Ⅰ-/-老鼠肺部炎癥,膠