版權(quán)說(shuō)明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請(qǐng)進(jìn)行舉報(bào)或認(rèn)領(lǐng)
文檔簡(jiǎn)介
1、第一部分、CD2AP在腎臟細(xì)胞中的分布及其在足細(xì)胞中的作用初探。 目的:觀察CD2相關(guān)蛋白(CD2AP)在腎臟不同細(xì)胞系中的表達(dá)分布,及其與足細(xì)胞裂孔隔膜分子nephrin和細(xì)胞骨架蛋白F-actin之間的聯(lián)系。 方法:以DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)人系膜細(xì)胞(HMC)和人腎小管上皮細(xì)胞系(HK-2),RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)條件永生化小鼠足細(xì)胞系。以RT-PCR及Western blot方法檢測(cè)足細(xì)胞內(nèi)CD2AP和nephr
2、in的表達(dá)。間接免疫熒光結(jié)合激光共聚焦方法觀察CD2AP在HMC、HK-2、未分化及已分化足細(xì)胞中的表達(dá)情況,及CD2AP與nephrin在足細(xì)胞中的共存。直接免疫熒光結(jié)合激光共聚焦方法觀察F-actin在足細(xì)胞的表達(dá)及其與CD2AP的共存。 結(jié)果:CD2AP均勻分布于HK-2及未分化足細(xì)胞的核周及胞漿,而不表達(dá)于HMC細(xì)胞。在足細(xì)胞分化過(guò)程中,CD2AP的分布發(fā)生了變化,出現(xiàn)向周邊聚集的現(xiàn)象。CD2AP與足細(xì)胞裂孔隔膜分子ne
3、phrin及細(xì)胞骨架蛋白F-actin在足細(xì)胞中存在共定位關(guān)系。 結(jié)論:CD2AP表達(dá)于上皮來(lái)源的腎臟固有細(xì)胞。CD2AP在足細(xì)胞中的分布特點(diǎn),提示CD2AP可能參與足細(xì)胞的分化過(guò)程,并與裂孔隔膜分子功能及細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)有關(guān)。 第二部分、CD2AP在足細(xì)胞中的生理功能研究。 論文1:CD2AP在足細(xì)胞分化中的作用。 目的:本文旨在研究未分化和分化足細(xì)胞生物學(xué)性狀及CD2相關(guān)蛋白(CD2AP)在足細(xì)胞分化過(guò)程
4、中的作用。 方法:體外33 ℃許可條件下培養(yǎng)由H-2Kb-tsA58轉(zhuǎn)基因小鼠所建立的未分化足細(xì)胞系,并在37 ℃非許可條件下誘導(dǎo)其分化。觀察足細(xì)胞分化后形態(tài)學(xué)改變;MTT法測(cè)定細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線;紅色熒光染料PKH-26標(biāo)記足細(xì)胞,追蹤其在子代細(xì)胞中的分布,檢測(cè)細(xì)胞增殖能力;流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期的改變;Western印跡檢測(cè)足細(xì)胞相關(guān)蛋白CD2AP、α-actinin和足細(xì)胞分化相關(guān)蛋白nephrin的表達(dá);免疫熒光結(jié)合激光共聚
5、焦方法檢測(cè)CD2AP、nephrin、α-actinin、F-肌動(dòng)蛋白和微管蛋白的表達(dá)變化。用CD2AP siRNA轉(zhuǎn)染未分化足細(xì)胞后置于37℃非許可條件下培養(yǎng),并設(shè)非許可條件下未轉(zhuǎn)染組為對(duì)照組。檢測(cè)足細(xì)胞的生長(zhǎng)速度的變化以及足細(xì)胞分化標(biāo)志物synaptopodin的表達(dá)。 結(jié)果:與未分化足細(xì)胞相比,分化足細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變,生長(zhǎng)速度減慢,增殖能力下降(P<0.05);細(xì)胞周期表現(xiàn)為G0/G1期細(xì)胞比例的增多和S期及G2/M期的細(xì)
6、胞比例下降(P<0.05);CD2AP、nephrin和α-actinin的表達(dá)明顯增高(P<0.05);CD2AP、nephrin、α-actinin、F-肌動(dòng)蛋白和微管蛋白在表達(dá)分布上均發(fā)生明顯的改變。Synaptopodin僅表達(dá)于已分化足細(xì)胞,在未分化足細(xì)胞無(wú)表達(dá)。轉(zhuǎn)染特異性siRNA下調(diào)CD2AP表達(dá)后,細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯減慢,synaptopodin mRNA表達(dá)下調(diào)(P<0.05),細(xì)胞分化遲滯。 結(jié)論:足細(xì)胞分化過(guò)
7、程中伴隨細(xì)胞骨架的重新分布和細(xì)胞形態(tài)的改變;CD2AP可能作為足細(xì)胞裂孔隔膜分子與細(xì)胞骨架的連接蛋白,在足細(xì)胞分化過(guò)程中發(fā)揮重要作用。 論文2:CD2AP在足細(xì)胞增殖和分裂中的作用。 目的:觀察敲低足細(xì)胞CD2相關(guān)蛋白(CD2AP)表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖和分裂的影響,探討CD2AP在足細(xì)胞損傷和蛋白尿發(fā)病機(jī)理中的作用。 方法:采用RPMI 1640培養(yǎng)基,在33℃許可條件下培養(yǎng)永生化小鼠足細(xì)胞系。以PKH-26紅色熒光染
8、料標(biāo)記足細(xì)胞后,用Metafectene轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染針對(duì)CD2AP的小分子干擾RNA(siRNA)。轉(zhuǎn)染24h后流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率;48h 后RT-PCR和Western印跡檢測(cè)轉(zhuǎn)染后CD2AP mRNA和蛋白表達(dá);72h后以流式細(xì)胞儀檢測(cè)足細(xì)胞增殖指數(shù)及細(xì)胞周期;用Oregon Green? 488標(biāo)記的Paclitaxel直接標(biāo)記足細(xì)胞內(nèi)的微管蛋白,激光共聚焦顯微鏡下檢測(cè)雙核及多核足細(xì)胞的比例。 結(jié)果:流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示
9、,CD2AP特異性siRNA轉(zhuǎn)染效率為66.27%。轉(zhuǎn)染siRNA 48h后,CD2AP mRNA和蛋白表達(dá)分別下降57%和39%。轉(zhuǎn)染72h后,足細(xì)胞增殖指數(shù)明顯下降(p<0.05),G2/M期的細(xì)胞數(shù)量明顯增多(p<0.05)。共聚焦顯微鏡下可見(jiàn)轉(zhuǎn)染CD2AP siRNA后,部分細(xì)胞有絲分裂后不能分離,雙核及多核足細(xì)胞的比例明顯增加(p<0.05)。 結(jié)論:CD2AP表達(dá)降低可能通過(guò)阻礙足細(xì)胞增殖和有絲分裂,導(dǎo)致足細(xì)胞損傷。
10、 論文3:CD2AP在足細(xì)胞黏附和胞質(zhì)伸展中的作用。 目的:觀察抑制足細(xì)胞CD2相關(guān)蛋白(CD2AP)表達(dá)對(duì)細(xì)胞黏附和胞質(zhì)伸展功能的影響,并初步探討其機(jī)制。 方法:用RPMI 1640培養(yǎng)基33℃下培養(yǎng)小鼠未分化足細(xì)胞系,轉(zhuǎn)染針對(duì)CD2AP的小分子干擾RNA(siRNA),設(shè)無(wú)特異靶位點(diǎn)的Scrambing序列即Control siRNA轉(zhuǎn)染組作對(duì)照。48h后將轉(zhuǎn)染的足細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液,接種于預(yù)鋪有Ⅳ型膠原蛋
11、白的96孔板內(nèi),33℃下培養(yǎng)90min后檢測(cè)足細(xì)胞的貼壁率和細(xì)胞的伸展面積,流式細(xì)胞儀檢測(cè)抑制CD2AP后足細(xì)胞的凋亡率以及在不同PAN刺激下足細(xì)胞的凋亡率。激光共聚焦顯微鏡下檢測(cè)微絲蛋白的分布變化。Western印跡和免疫共沉淀檢測(cè)nephrin蛋白的表達(dá)及其磷酸化水平。 結(jié)果:轉(zhuǎn)染CD2AP siRNA足細(xì)胞的黏附率和細(xì)胞伸展的面積明顯低于對(duì)照組(P<0.05);轉(zhuǎn)染CD2AP siRNA后48h足細(xì)胞的凋亡率高于對(duì)照組,有
12、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。100μg/ml的PAN能明顯誘導(dǎo)足細(xì)胞的凋亡,減少足細(xì)胞的黏附率(P<0.05)。敲低CD2AP的表達(dá)后足細(xì)胞微絲蛋白的分布發(fā)生明顯的變化,nephrin蛋白表達(dá)和磷酸化水平下降(P<0.05)。 結(jié)論:敲低CD2AP的表達(dá)使足細(xì)胞易于凋亡,影響細(xì)胞的黏附功能;足細(xì)胞骨架蛋白的紊亂和nephrin信號(hào)通路的抑制可能是足細(xì)胞黏附和伸展功能下降的機(jī)制。 第三部分、CD2AP在白蛋白內(nèi)吞中的作用機(jī)
13、制初探。 目的:觀察足細(xì)胞對(duì)白蛋白的吞噬作用以及白蛋白過(guò)負(fù)荷對(duì)足細(xì)胞的損傷,并探討CD2AP在其中的作用。 方法:本研究采用化學(xué)方法制備FITC標(biāo)記的白蛋白,在33℃許可條件下培養(yǎng)由H-2Kb-tsA58轉(zhuǎn)基因小鼠所建立的未分化足細(xì)胞系,并模擬體內(nèi)足細(xì)胞在腎小球鮑曼氏囊內(nèi)所處的蛋白尿環(huán)境,免疫熒光結(jié)合激光共聚焦方法研究足細(xì)胞對(duì)白蛋白的吞噬功能以及 CD2AP與FITC-BSA在足細(xì)胞中的共定位,Western印跡檢測(cè)CD
14、2AP的表達(dá),流式細(xì)胞儀檢測(cè)足細(xì)胞的凋亡,透射電鏡檢測(cè)細(xì)胞的超微結(jié)果變化。 結(jié)果:在生理范圍尿白蛋白濃度下(0.05mg/ml),即可發(fā)現(xiàn)足細(xì)胞對(duì)白蛋白具有吞噬功能。在大劑量白蛋白濃度下(1mg/ml),足細(xì)胞吞噬白蛋白存在時(shí)間效應(yīng),呈S型曲線,在2h后達(dá)到平衡狀態(tài)。激光共聚焦顯微鏡證實(shí)在CD2AP與FITC-BSA在足細(xì)胞內(nèi)存在共聚關(guān)系。BSA刺激12h后CD2AP的表達(dá)明顯上調(diào),凋亡的足細(xì)胞增多,細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無(wú)特殊說(shuō)明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請(qǐng)下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請(qǐng)聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁(yè)內(nèi)容里面會(huì)有圖紙預(yù)覽,若沒(méi)有圖紙預(yù)覽就沒(méi)有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 眾賞文庫(kù)僅提供信息存儲(chǔ)空間,僅對(duì)用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對(duì)用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對(duì)任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
- 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請(qǐng)與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時(shí)也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對(duì)自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 足細(xì)胞裂孔膜相關(guān)蛋白基因NPHS2、CD2AP的研究.pdf
- 高糖、AngⅡ?qū)π∈笞慵?xì)胞凋亡及PKC活性、Nephrin、CD2AP表達(dá)的影響.pdf
- 高血壓腎損傷患者足細(xì)胞相關(guān)蛋白Nephrin及CD2AP表達(dá)變化的研究.pdf
- 羅格列酮對(duì)阿霉素腎病大鼠足細(xì)胞podocin和CD2AP蛋白表達(dá)的影響.pdf
- 復(fù)方仙草顆粒對(duì)阿霉素誘導(dǎo)損傷的人腎小球足細(xì)胞CD2AP及nephrin表達(dá)的影響.pdf
- 羅格列酮對(duì)阿霉素腎病大鼠足細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)及Podocin、CD2AP mRNA表達(dá)的影響.pdf
- Nephrin和CD2AP在阿霉素腎病大鼠蛋白尿發(fā)生中作用的研究.pdf
- CD2AP在腎病綜合征蛋白尿發(fā)生機(jī)制中的作用的研究.pdf
- MFG-E8在小膠質(zhì)細(xì)胞生理功能中的作用研究.pdf
- 自發(fā)性高血壓大鼠醛固酮水平對(duì)腎足細(xì)胞損傷和CD2AP表達(dá)的影響及依普利酮的作用.pdf
- 血液的生理功能
- 血液的生理功能
- 舒洛地特對(duì)膜性腎病大鼠腎臟中podocin、CD2AP、nephrin表達(dá)的影響.pdf
- 甲狀腺的生理功能
- 鐵的生理功能
- 鯉魚赤小豆湯對(duì)阿霉素腎病大鼠Nephrin、CD2AP表達(dá)的影響.pdf
- 肝臟的主要生理功能
- 鐵脅迫對(duì)葉肉細(xì)胞和葉鞘細(xì)胞生理功能的影響.pdf
- 物質(zhì)的生理功能歸納
- 卵巢的解剖和生理功能
評(píng)論
0/150
提交評(píng)論