兩種膜孕激素受體在鲆鰈類中的生理功能研究.pdf

1、本研究以工廠化養(yǎng)殖的半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis Günther)和牙鲆(Paralichthys olivaceus)為研究對象，運用組織學(xué)切片、熒光實時定量、RNA原位雜交、免疫組織化學(xué)、免疫印跡等方法，對半滑舌鰨和牙鲆親魚卵巢中不同發(fā)育時期的卵母細胞、不同組織中膜孕激素受體（mPRα）和新型膜孕激素受體（mPRL）基因及其蛋白的表達特征進行了定量和定性研究；并研究了外源促性腺激素對半滑舌鰨成熟卵巢不同發(fā)育

2、時期卵母細胞這mPRα、mPRL基因和蛋白的表達影響。通過分析半滑舌鰨和牙鲆卵母細胞不同發(fā)育階段和繁殖相關(guān)組織中mPRα和mPRL的表達情況，為探討兩種膜孕激素受體的生理功能奠定基礎(chǔ)，同時為提高鲆鰈類的人工繁殖技術(shù)提供了理論依據(jù)。研究結(jié)果如下：
　　1．半滑舌鰨mPRα和mPRL在不同發(fā)育時相卵母細胞中基因的表達量變化
　　通過Real-time熒光定量和western-blotting技術(shù)研究了mPRα和mPRL在舌鰨不同

3、卵巢發(fā)育期的不同發(fā)育時相卵母細胞中基因的表達，以及不同濃度 HCG處理對卵巢發(fā)育 V期魚不同發(fā)育時相卵母細胞mPRα和mPRL基因和蛋白的表達影響。結(jié)果顯示：在不同發(fā)育期卵巢中，mPRα和mPRL mRNA的表達最高值出現(xiàn)在半滑舌鰨卵母細胞的不同發(fā)育時相，但整體趨勢大體一致。在卵巢發(fā)育II期，處于II時相的卵母細胞mPRα、mPRL mRNA的表達量最高（P<0.05）。在卵巢發(fā)育III和IV期，處于IV時相的卵母細胞mPRα、mPRL

4、 mRNA表達量最高（P<0.05）。在卵巢發(fā)育V期，處于V時相卵母細胞mPRα、mPRL mRNA表達量最高（P<0.05）。卵母細胞mPRα、mPRL mRNA表達的最高值出現(xiàn)在性腺發(fā)育V期舌鰨的V時相卵母細胞，表明mPRα和mPRL主要在成熟階段發(fā)揮作用。
　　采用不同濃度HCG處理卵巢發(fā)育V期舌鰨不同時相的卵母細胞，并對其表達量進行檢測。結(jié)果顯示：20IU/ml HCG對mPRα與mPRL mRNA和蛋白表達的調(diào)控作用比1

5、0IU/ml HCG作用更明顯，表明mPRα和mPRL mRNA和蛋白表達對HCG調(diào)控作用存在劑量依存關(guān)系。并且HCG對舌鰨不同時相的卵母細胞的促成熟作用效果不同，在V時相促進作用最明顯（P<0.05），表明mPRα和mPRL主要在成熟階段發(fā)揮作用。HCG激素調(diào)控作用下，mPRα和mPRL的正向應(yīng)答效應(yīng)預(yù)示其參與了卵母細胞成熟調(diào)控。
　　2．半滑舌鰨mPRα和mPRL在不同組織中基因和蛋白表達分析
　　通過western-b

6、lotting技術(shù)分析舌鰨不同組織中mPRα和mPRL的蛋白表達量情況。通過RNA原位雜交、免疫組化等方法分析舌鰨不同組織切片中mPRα、mPRL mRNA和蛋白的分布情況。免疫印跡結(jié)果顯示：mPRα和mPRL蛋白在性腺、腦中表達量較高，在肝、腎、頭腎、垂體組織中也有表達，但表達量相對較低；說明mPRα和mPRL主要在性腺、腦組織中發(fā)揮作用。RNA原位雜交、免疫組化結(jié)果顯示：mPRα、mPRL mRNA和蛋白都在卵巢成熟期的卵母細胞膜上

7、表達豐富。mPRα和mPRL的陽性信號物質(zhì)在卵母細胞的細胞膜中分布明顯。進一步證明 mPRα和mPRL為膜上的受體并在膜上行使其生理功能。在舌鰨肝臟、腎臟、頭腎、腦、垂體也都檢測到mPRα和mPRL陽性信號，分布于組織的不同部位。mPRα和mPRL在垂體、頭腎、腎臟、腦、肝臟上均有表達，在垂體、頭腎、腎臟、腦上主要顯色在組織的外周部分，在外周部位呈零星分布。在肝臟主要顯色在膽小管和肝靜脈等與外界聯(lián)系的管腔周圍，在腎臟中也觀察到其在腎小管

8、附近表達豐富。進一步從形態(tài)學(xué)上解析 mPRα和mPRL在不同組織中的表達特點，證明其在不同組織中能夠介導(dǎo)孕激素行使不同生理作用。
　　3．牙鲆mPRα和mPRL在不同發(fā)育時相卵母細胞中基因表達分析
　　通過Real-time熒光定量技術(shù)分析研究了mPRα和mPRL在成熟卵巢中不同發(fā)育時期卵母細胞中基因的表達。結(jié)果顯示：卵母細胞mPRα、mPRL mRNA表達的最高值出現(xiàn)在性腺發(fā)育V期牙鲆的V時相卵母細胞（P<0.05）。 m

9、PRα、mPRL mRNA表達變化趨勢的一致性說明mPRα、mPRL基因在性腺發(fā)育V期牙鲆的V時相卵母細胞的作用效果最明顯。
　　4．牙鲆mPRα和mPRL在不同組織中基因和蛋白表達分析
　　通過 western-blotting技術(shù)分析不同組織中 mPRα和mPRL的蛋白表達量情況。通過RNA原位雜交、免疫組化等技術(shù)分析不同組織中mPRα、mPRL mRNA和蛋白的分布情況。免疫印跡結(jié)果顯示：mPRα和mPRL蛋白在腦、性

10、腺中表達量都很高，在肝、腎、頭腎組織中也有表達，但表達量相對較低。說明mPRα和mPRL主要在性腺和腦組織中發(fā)揮作用。RNA原位雜交、免疫組化結(jié)果顯示：mPRα、mPRL mRNA和蛋白都在卵巢成熟期的卵母細胞膜上顯著表達。mPRα、mPRL mRNA基因雜交的陽性信號物質(zhì)在卵母細胞的細胞膜中分布明顯；從形態(tài)學(xué)上進一步證明mPRα和mPRL為膜上的受體，并在膜上行使其生理功能。在肝臟、腎臟、頭腎、腦也都檢測到mPRα和mPRL的雜交信號