促性腺激素在雌性半滑舌鰨繁殖周期的生理功能研究.pdf

1、本文以人工養(yǎng)殖半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis Günther）為研究對(duì)象，運(yùn)用組織學(xué)、內(nèi)分泌學(xué)方法、激素放射免疫測(cè)定方法以及分子生物學(xué)方法，對(duì)半滑舌鰨卵巢發(fā)育、促性腺激素（Gonadotropin Hormone, GtH）水平周期變化及其基因的克隆、表達(dá)水平等進(jìn)行了系統(tǒng)的分析與研究，以期進(jìn)一步闡明GtH的生理功能，為改善工廠化養(yǎng)殖魚類的生殖調(diào)控提供有價(jià)值的參考信息。主要研究?jī)?nèi)容與結(jié)果如下：
　　1.半滑舌

2、鰨促性腺激素α亞基（CGα）基因的克隆及其時(shí)空表達(dá)分析
　　采用RACE方法，從半滑舌鰨腦垂體中克隆了CGα全長(zhǎng)cDNA。半滑舌鰨CGα基因全長(zhǎng)為685bp，其開放閱讀框?yàn)?84bp，編碼了含127個(gè)氨基酸的蛋白，N端33個(gè)氨基酸為信號(hào)肽。半滑舌鰨CGα成熟肽與其它脊椎動(dòng)物CGα成熟肽結(jié)構(gòu)特征相似，具有10個(gè)半胱氨酸殘基和2個(gè)N-糖基化位點(diǎn)。CGα成熟肽序列分析表明，半滑舌鰨CGα與鰈形目和鱸形目魚類CGα同源性最高為60-70％

3、。
　　實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明，半滑舌鰨CGαmRNA在被檢測(cè)的12個(gè)組織中均有表達(dá)，在垂體組織中大量表達(dá)，其次是鰓、腎臟、肌肉、卵巢和腦組織，在心臟、頭腎、肝和脾等組織中只微量表達(dá)；對(duì)繁殖周期CGα表達(dá)水平進(jìn)行測(cè)定有助于理解魚類的分子調(diào)控機(jī)理。RT-PCR結(jié)果表明，繁殖周期雌性半滑舌鰨CGαmRNA在Ⅳ、Ⅴ期表達(dá)量最豐富。
　　2.半滑舌鰨促濾泡激素（FSH）基因全長(zhǎng)cDNA克隆、時(shí)空表達(dá)
　　利用RT-PCR和

4、RACE技術(shù)首次克隆得到半滑舌鰨FSH基因全長(zhǎng)cDNA序列。全長(zhǎng)為541bp，開放閱讀框?yàn)?93bp，編碼130個(gè)氨基酸。發(fā)現(xiàn)一個(gè)N-糖基化位點(diǎn)：24-27 NTT。與其它脊椎動(dòng)物的FSH成熟肽氨基酸序列同源性比較表明：半滑舌鰨FSH與鰈形目和鱸形目魚類FSH同源性最高為42-49%。
　　實(shí)時(shí)熒光定量PCR組織表達(dá)分析表明，F(xiàn)SH mRNA除在垂體中大量表達(dá)外，其他組織也有表達(dá)，尤以腦、性腺表達(dá)量較高。半滑舌鰨 FSH mRNA

5、在垂體以外組織中的廣泛表達(dá)，暗示FSH可能具有廣泛的生理功能。RT-PCR方法對(duì)繁殖周期雌性半滑舌鰨FSH基因表達(dá)水平進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，F(xiàn)SH mRNA在Ⅳ期表達(dá)促性腺激素在雌性半滑舌鰨繁殖周期的生理功能研究量最豐富。
　　3.半滑舌鰨促黃體激素（LH）基因全長(zhǎng)cDNA克隆、時(shí)空表達(dá)
　　利用RACE技術(shù)首次克隆了半滑舌鰨腦垂體中LH基因cDNA全長(zhǎng)序列。該基因全長(zhǎng)670bp，開放閱讀框?yàn)?77bp，編碼158個(gè)氨基酸。與

6、其它脊椎動(dòng)物的LH成熟肽氨基酸序列同源性比較表明：半滑舌鰨 LH與鰈形目和鱸形目同源性高58-68%。另外，半滑舌鰨LH含有12個(gè)保守的半胱氨酸殘基和1個(gè)N-糖基化位點(diǎn)（19-21NQT）。
　　實(shí)時(shí)熒光定量組織表達(dá)分析表明，LH mRNA在腦、垂體、鰓、心、頭腎、腎、肝臟、脾臟、胃、腸、卵巢、肌肉這12組織中均有表達(dá)，垂體中表達(dá)量最豐富，其他組織尤以腦、性腺表達(dá)量較高。推測(cè)半滑舌鰨LH可能具有廣泛的垂體外生理功能；RT-PCR方

7、法對(duì)繁殖周期雌性半滑舌鰨LH表達(dá)水平進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，LH mRNA在Ⅳ、Ⅴ期表達(dá)量最豐富。
　　4.促性腺激素（GtH）含量測(cè)定及周年變化規(guī)律
　　利用125I標(biāo)記的放射免疫測(cè)定（RIA）技術(shù)檢測(cè)繁殖周期半滑舌鰨血漿GtH濃度及周年變化規(guī)律。結(jié)果表明：FSH在繁殖周期的Ⅳ期表達(dá)量最豐富；而LH在Ⅴ期表達(dá)量最大。雌性半滑舌鰨血漿FSH和LH濃度的周年變化相似，呈現(xiàn)明顯的周期性規(guī)律，都在9月時(shí)出現(xiàn)全年周期中的波峰。統(tǒng)計(jì)分析表