牙鲆促性腺激素釋放激素及其免疫影響的研究.pdf

1、促性腺激素釋放激素(GnRH)是下丘腦-垂體-性腺軸的關鍵信息分子，在脊椎動物生殖神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)控中特別是在刺激促性腺激素的合成和釋放方面具有至關重要的調(diào)節(jié)作用，是神經(jīng)-免疫-內(nèi)分泌三大調(diào)節(jié)系統(tǒng)之間互相聯(lián)系的信使之一，魚類GnRH及其受體結構和生物學功能逐漸成為神經(jīng)內(nèi)分泌和生殖生物學研究的熱點之一。牙鲆(Paralichthys olivaceus)，屬硬骨魚綱，鰈形目，鲆科(Bothidae)，是中國重要的海水養(yǎng)殖魚類，關于牙鲆GnRH

2、及其受體的分子生殖內(nèi)分泌研究未見報道，了解牙鲆GnRH及其受體的類型、分布和作用，對闡明牙鲆神經(jīng)-生殖-內(nèi)分泌的相互調(diào)控具有有十分重要的意義。本論文的研究結果如下： (1)本文采用免疫組織化學技術檢測了GnRH和NPY在性成熟牙鲆組織內(nèi)的分布。表明：GnRH陽性細胞分布于腦、垂體、胃、腸、卵巢等神經(jīng)、消化和生殖器官；NPY在延腦、大腦、卵巢中檢測到了陽性反應細胞。 (2)采用RACE技術獲得牙鲆607 bp全長cGn

3、RH-II cDNA，編碼95個氨基酸的前體肽。該cGnRH-Ⅱ前體肽包含有23個氨基酸殘基的信號肽、cGnRH-Ⅱ成熟十肽(QHWSHGwYPG)、一個3肽(Gly-Lys-Arg)加工位點和49個氨基酸殘基的促性腺激素釋放激素相關肽(GAP)。前體氨基酸序列同源性分析表明，牙鲆cGnRH-Ⅱ前體與條斑星鰈(barfin flounder)相似性最高為97.6％，其次是軍曹魚科、麗魚科和鯛科魚類；與哺乳動物、爬行動物和兩棲動物同源性較

4、低。RT-PCR檢測顯示，cGnRH-Ⅱ基因在牙鲆腎臟、腦、垂體、鰓和卵巢中表達；以腎臟中表達水平最高。 (3)克隆獲得了牙鲆395 bp全長sbGnRH cDNA，編碼98個氨基酸的sbGnRH前體。該sbGnRH前體肽包含有26個氨基酸殘基的信號肽、sGnRH成熟十肽(QHWSYGLSPG)、一個三肽(Gly-Lys-Arg)加工位點和59個氨基酸殘基組成的GAP。前體氨基酸序列同源性分析表明，牙鲆sbGnRH與條斑星鰈的

5、同源性最高為86.7‰RT-PCR檢測顯示，sbGnRH基因在牙鲆腦、胃、脾臟、眼、垂體、肌肉、腸、卵巢中皆有表達。 (4)利用3'-RACE技術克隆得到了牙鲆391 bp sGnRH cDNA 3'-末端片段序 列，該片段預測能編碼61個氨基酸殘基的不完全sGnRH前體肽，包含有sGnRH十肽的后4個氨基酸殘基“WLPG”、一個3肽(Gly-Lys—Arg)加工位點信號和54個氨基酸殘基的GAP。sGnRH 3’-

6、末端cDNA含有205 bp的3’-UTR。 (5)利用RACE和nest-PCR．結合技術克隆獲得了牙鲆1671 bp GnRH-R全長cDNA序列，包含147 bp的5’-UTR、1248 bp ORF和276 bp的3’-LJTR，編碼415個氨基酸。結構域預測表明，牙鲆CmRH-R含有7個跨膜結構域，屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族A視紫質樣(Rhodopsin-like)亞家族，具有典型的G蛋白偶聯(lián)受體特征：包含1個胞外N．末

7、端尾巴、3個胞外loop、3個胞內(nèi)。loop、由ECLs和ICLs連接的7個跨膜α螺旋以及1個胞內(nèi)C-末端尾巴。GnRH受體進行蛋白活性位點搜索發(fā)現(xiàn)，牙鲆GnRH受體具有多個糖基化位點、酪蛋白激酶II(CK II)、磷酸激酶C(PKC)和磷酸激酶A(PKA)磷酸化位點，這些位點對于GnRH-R．的活性和偶聯(lián)反應具有重要功能。RT-PCR檢測表明牙鲆GnRH-R mRNA在腦、睪丸、腎臟、眼睛和卵巢中均有較強的表達。 (6)本文

8、探討了GnRH類似物(GnRH-A．)對活體牙鲆垂體中GnRH-R、GtHα、GtHI-β、GtHII-β和GH中轉錄水平的影響，試驗結果表明，GnRH-A能夠誘導牙鲆GnRH-R．、GtHα、GtHI-β、GtHII-β和GH mRNA表達水平的升高，分別在處理后6h、12h、36h、12h和12h達到高峰。 (7)采用離體培養(yǎng)和活體實驗相結合的方法，研究了CmRH-A對牙鲆淋巴細胞分泌IL-2的影響。體外實驗結果表明，低濃