星突江鰈生長(zhǎng)激素和胰島素樣生長(zhǎng)因子的生理功能及體外重組研究.pdf

1、本文以星突江鰈（Platichthysstellatus）為研究對(duì)象，運(yùn)用 RACE方法克隆了星突江鰈生長(zhǎng)激素(GH, Growth hormone）、胰島素樣生長(zhǎng)因子 I和Ⅱ(IGF-I,Ⅱ;Insulin-like growth factor-I,Ⅱ)的cDNA序列，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)了GH、IGF-I和IGF-ⅡmRNA在不同胚胎、仔稚魚(yú)發(fā)育階段和成魚(yú)不同組織中的時(shí)空表達(dá)模式；運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)結(jié)合組織學(xué)及激素放射免

2、疫測(cè)定技術(shù)對(duì) GH、IGF-I和IGF-Ⅱ在星突江鰈卵巢發(fā)育中的調(diào)節(jié)作用進(jìn)行了初步研究；最后利用原核表達(dá)技術(shù)實(shí)現(xiàn)了星突江鰈GH、IGF-I和IGF-II成熟肽體外重組表達(dá)和生物活性檢測(cè)，獲得了具有生物活性的重組蛋白。本研究結(jié)果為揭示星突江鰈生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控機(jī)制及健康養(yǎng)殖技術(shù)構(gòu)建提供了基礎(chǔ)資料和理論支撐。主要研究結(jié)果如下：
　　1.星突江鰈GH、IGF-I和IGF-Ⅱ的基因克隆和組織表達(dá)分析
　　采用RACE方法，首次從星突江鰈垂

3、體中克隆到GH cDNA全長(zhǎng)序列，從肝臟中克隆到IGF-I和IGF-Ⅱ cDNA全長(zhǎng)序列。星突江鰈GH基因全長(zhǎng)957bp，編碼204個(gè)氨基酸，其中成熟肽包含180個(gè)氨基酸，含有4個(gè)保守的半胱氨酸殘基和1個(gè)C端糖基化位點(diǎn)。IGF-I和IGF-II基因cDNA全長(zhǎng)分別為1268bp和899bp，各編碼185個(gè)和215個(gè)氨基酸，切除信號(hào)肽和E區(qū)后分別形成包含B-C-A-D區(qū)的141個(gè)和168個(gè)氨基酸的成熟肽，均有高度保守的6個(gè)半胱氨酸殘基，形

4、成3對(duì)二硫鍵。
　　實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，星突江鰈GH mRNA主要在垂體中表達(dá)，此外在腦、性腺、胃和肌肉中有微量表達(dá)，且雌魚(yú)胃和肌肉的GH mRNA表達(dá)量高于雄魚(yú)。IGF-I mRNA主要在肝臟中表達(dá)，所檢測(cè)的其他12個(gè)組織中也均有相對(duì)較低表達(dá)，且雌魚(yú)肝臟、性腺、鰓、心臟和腎臟中 IGF-I mRNA表達(dá)量高于雄魚(yú)，而在垂體中則相反（P＜0.05）。IGF-ⅡmRNA主要在雌魚(yú)肝臟中表達(dá)，而在雄魚(yú)肝、腦和鰓均有較高表達(dá)，其

5、他所檢測(cè)組織中也有低量表達(dá)，且雌魚(yú)垂體、性腺、肝臟、心臟、頭腎、腎、脾臟、胃和腸中IGF-ⅡmRNA表達(dá)量高于雄魚(yú)，而雌魚(yú)腦中IGF-ⅡmRNA卻低于雄魚(yú)（P＜0.05）。雌雄魚(yú)組織間GH、IGF-I和IGF-ⅡmRNA表達(dá)差異顯示GH/IGFs軸可能與星突江鰈的性別二態(tài)性生長(zhǎng)特性有關(guān)。
　　2.星突江鰈GH、IGF-I和IGF-ⅡmRNA在早期生長(zhǎng)發(fā)育中的表達(dá)特性
　　實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，星突江鰈GH mRNA在胚

6、胎發(fā)育階段未檢測(cè)到表達(dá)，最早在1日齡仔魚(yú)中檢測(cè)到表達(dá)，表達(dá)水平在1-60日齡內(nèi)隨苗種生長(zhǎng)發(fā)育而逐漸升高（P＜0.05）。IGF-I和IGF-Ⅱ mRNA在未受精卵和胚胎發(fā)育中均表達(dá)，IGF-I mRNA在受精卵至高囊胚期表達(dá)量較高（P＜0.05），原腸后期明顯下降（P＜0.05）至初孵仔魚(yú)維持在較低水平，在1-60日齡內(nèi)隨苗種生長(zhǎng)發(fā)育而逐漸升高（P＜0.05）。IGF-Ⅱ低囊胚期前表達(dá)量較低，低囊胚期時(shí)達(dá)峰值而后逐漸下降（P＜0.05）

7、至初孵仔魚(yú)達(dá)最低值達(dá)到，在1-18日齡內(nèi)表達(dá)量逐漸升高（P＜0.05）而后逐漸降低（P＜0.05）。上述結(jié)果表明GH、IGF-I和IGF-II可能在星突江鰈的早期生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控中發(fā)揮重要作用。
　　3.星突江鰈GH、IGF-I和IGF-II對(duì)卵巢發(fā)育的調(diào)控機(jī)制研究
　　利用組織切片技術(shù)將星突江鰈卵巢年周期發(fā)育過(guò)程劃分為Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ5個(gè)時(shí)期。血漿激素放射免疫測(cè)定結(jié)果和實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明，星突江鰈卵巢發(fā)育Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ期

8、垂體GH mRNA表達(dá)量及血漿GH均處于較低水平（P＜0.05），而肝臟IGF-I mRNA表達(dá)量及血漿IGF-I表達(dá)水平隨卵巢發(fā)育而逐漸升高至Ⅴ期達(dá)到峰值，排卵結(jié)束后顯著下降（P＜0.05）。卵巢IGF-I和IGF-ⅡmRNA表達(dá)水平隨卵巢發(fā)育逐漸升高至Ⅵ期時(shí)達(dá)到最高值（P＜0.05）。血漿T水平隨卵巢發(fā)育升高至Ⅴ期達(dá)峰值，排卵后顯著下降（P＜0.05）；血漿E2也隨卵巢發(fā)育升高但在Ⅳ期達(dá)峰值，后在Ⅴ、Ⅵ期顯著下降（P＜0.05）。上

9、述結(jié)果顯示GH、IGF-I和IGF-Ⅱ可能通過(guò)自分泌、內(nèi)分泌和旁分泌等多種途徑參與到星突江鰈卵巢發(fā)育調(diào)控過(guò)程。
　　4.星突江鰈GH、IGF-I和IGF-Ⅱ成熟肽的原核表達(dá)及活性分析
　　根據(jù)克隆得到的星突江鰈GH、IGF-I和IGF-ⅡcDNA全長(zhǎng)序列，設(shè)計(jì)帶酶切位點(diǎn)引物克隆得到GH、IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ成熟肽序列。利用PCR方法將擴(kuò)增片段連接到原核表達(dá)載體 pET-28a上，得到的重組質(zhì)粒導(dǎo)入到大腸桿菌 BL21(DE

10、3)后經(jīng)IPTG誘導(dǎo)產(chǎn)生N端含His標(biāo)簽的融合蛋白。以SDS-PAGE電泳檢測(cè)和SigmaScan軟件分別確定GH、IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ重組蛋白誘導(dǎo)的最佳溫度、誘導(dǎo)劑濃度和時(shí)間，得到的GH、IGF-I和IGF-Ⅱ成熟肽重組蛋白分別占細(xì)菌總蛋白的45.2％、39.8%和42.7%，重組蛋白均以包涵體形式存在。Western blotting方法驗(yàn)證所獲得的蛋白均可特異性被6×His抗體識(shí)別并且蛋白分子量大小合適，誘導(dǎo)表達(dá)蛋白后的菌液沉淀

11、經(jīng)6mol/L鹽酸胍變性、Ni2+離子親和柱純化和尿素梯度復(fù)性，分別獲得大小為24.9kD、12.1kD和11.4kD的純化蛋白。利用人胚胎腎細(xì)胞HEK293T進(jìn)行細(xì)胞增殖誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)證明，IGF-I和IGF-Ⅱ重組蛋白均具有低濃度促進(jìn)和高濃度抑制細(xì)胞增殖的生物活性，而 GH重組蛋白則僅在高濃度條件下表現(xiàn)出抑制活性。星突江鰈GH、IGF-I和IGF-Ⅱ重組蛋白的獲得為魚(yú)類(lèi)GH/IGFs生理功能研究和專(zhuān)用綠色高效生長(zhǎng)添加劑的開(kāi)發(fā)提供了基礎(chǔ)資料