文昌魚甲狀腺激素-胰島素樣生長因子信號傳導(dǎo)通路的證明.pdf

1、文昌魚，頭索動物，長久以來一直被認(rèn)為是現(xiàn)存的與脊椎動物進(jìn)化關(guān)系最接近的無脊椎動物，是眾所周知的被廣泛用來比較種間基因組研究，發(fā)育的同源性分析和比較免疫學(xué)調(diào)查的模式生物。甲狀腺激素/胰島素樣生長因子信號途徑已確定在所有脊椎動物中都是存在的，但是它的進(jìn)化起源我們依然不清楚。在過去眾多的研究中，已經(jīng)證明了文昌魚中存在類甲狀腺(內(nèi)柱)和類肝臟(肝盲囊)的組織，也證明了文昌魚中存在與脊椎動物類似的甲狀腺-肝軸，那么文昌魚中是否存在原始的甲狀腺激素

2、/胰島素樣生長因子信號傳導(dǎo)通路?這是本論文主要研究的問題。
　　 在佛羅里達(dá)文昌魚和日本文昌魚中已經(jīng)克隆出一個編碼胰島素樣肽(ILP)的基因，它的氨基酸序列與與胰島素和胰島素樣生長因子都極為相似。功能研究表明ILP的功能更接近胰島素樣生長因子，因此我們將之重新命名為類胰島素樣生長因子(IGFl)。在本研究的第一部分，我們檢測了甲狀腺激素(T3)處理后，脊椎動物的實驗?zāi)Ｊ缴?斑馬魚肝臟的IGF-I基因和文昌魚肝盲囊的IGFl基因

3、的體內(nèi)體外表達(dá)模式，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在體外實驗中，T3能夠提高斑馬魚肝臟IGF-I基因和文昌魚肝盲囊IGFl基因的表達(dá)并呈現(xiàn)劑量依賴性的關(guān)系。而且T3誘導(dǎo)的斑馬魚肝臟IGF-I基因和文昌魚肝盲囊IGFl基因的表達(dá)在T3特異性抑制劑DEA的作用下，又明顯的被抑制。這些結(jié)果都表明T3對IGF-I/IGFl基因的特異性調(diào)節(jié)作用。當(dāng)T3濃度為100nM時，在時間依賴性實驗中，無論長時期實驗(42 h)還是短時期實驗(8 h)斑馬魚肝臟IGF-I基因

4、和文昌魚肝盲囊IGFl基因的表達(dá)在體外組織培養(yǎng)過程中隨著T3處理時間的變化表現(xiàn)出相似的模式和趨勢。并且在斑馬魚和文昌魚的體內(nèi)實驗中，T3處理72小時后，斑馬魚肝臟IGF-I基因和文昌魚肝盲囊IGFl基因的表達(dá)明顯提高。所有的實驗數(shù)據(jù)都指向一個結(jié)果，那就是T3對斑馬魚和文昌魚IGF基因的調(diào)節(jié)機(jī)制是類似的。這為頭索動物文昌魚中也是存在類似脊椎動物甲狀腺激素/胰島素樣生長因子信號途徑提供了一個新的證據(jù)。
　　 在本論文的第二部分，主要

5、是通過檢測這四個基因(ACTB，GAPDH，18SrRNA和EFla)在普通文昌魚的各個組織以及經(jīng)過LPS/LTA處理后的文昌魚組織中的表達(dá)水平的變化從而來評估它們作為qRT-PCR內(nèi)參基因的穩(wěn)定性。
　　 文昌魚作為處在從無脊椎動物到脊椎動物進(jìn)化節(jié)點位置的模式生物，有很多對這個物種基因的相關(guān)研究是通過qRT-PCR技術(shù)實現(xiàn)的，在qRT-PCR技術(shù)中，需要一個內(nèi)源性表達(dá)恒定的基因作為內(nèi)參對靶基因的相對表達(dá)水平進(jìn)行標(biāo)定來修正不同實

6、驗狀況對結(jié)果造成的差異。但是迄今為止卻沒有關(guān)于這個物種內(nèi)參基因的相關(guān)研究。在本論文的第二章，我們使用geNorm和NormFinder這兩個軟件通過檢測普通文昌魚魚體、消化道、去消化道魚體、肝盲囊、腮、后腸、脊索和肌肉中以及經(jīng)過不同濃度LPS和LTA處理的消化道和去消化道魚體來評估四個常用持家基因ACTB，GAPDH，18S rRNA和EFla的表達(dá)穩(wěn)定性。結(jié)果顯示在未經(jīng)處理的普通文昌魚的各個組織中18S rRNA的表達(dá)豐度是最高的，而