雞堆型艾美耳球蟲Rhomboid增強型核酸疫苗構建及免疫保護作用.pdf

1、雞球蟲病(Coccidiosis)是由艾美耳球蟲屬7種球蟲引起的腸道寄生蟲疾病，其中堆型艾美耳球蟲（Eimeria acervulina）是其主要病原之一。雞球蟲子孢子入侵到腸道上皮細胞并增殖使其嚴重受損從而導致飼料轉化率降低、增重降低，這給養(yǎng)禽生產業(yè)造成極大的損失。過去，雞球蟲病主要靠藥物防治，但是由此引發(fā)球蟲耐藥株的產生和藥物殘留等嚴重問題，現(xiàn)在球蟲疫苗免疫防治逐漸替代藥物防治，其中篩選有效的免疫抗原是制備高效新型球蟲疫苗的基礎和關

2、鍵。Rhomboid屬于廣泛分布的絲氨酸蛋白酶家族，在球蟲發(fā)育和信號轉導中執(zhí)行各種各樣功能，特別是在球蟲入侵過程中發(fā)揮著重要的作用，可能是其潛在的免疫性抗原。
　　根據(jù)GenBank柔嫩艾美耳球蟲Rhomboid基因序列(DQ323509.1)設計特異性引物，以堆型艾美耳球蟲cDNA為模板PCR擴增包含Rhomboid基因ORF片段?？乖砦环治龊笤O計表達區(qū)域特異性引物，PCR擴增后連接于pG EX-6p-1原核表達載體并成功構建

3、重組質粒pGEX-Rhomboid。將此質粒轉入E.coli Rosetta中IPTG誘導表達，SDS-PAGE顯示有36 ku預期蛋白表達。純化后的蛋白免疫新西蘭大白兔制備兔抗Rhomboid多抗。ELISA檢測多抗效價達216，Western-blot檢測表明制備的多抗具有良好的反應性和特異性。
　　本試驗同時構建pcDNA-Rhomboid及pcDNA-I FN-γ-Rhomboid重組真核表達質粒，體外瞬時轉染表明Rhom

4、boid及IFN-γ均可在BH K21細胞內表達，可用作免疫動物DNA疫苗使用。試驗雛雞分為5組，分別為兩個真核質粒免疫組即pcDNA-Rhomboid質粒免疫組(Rho組)和pcDNA-IFN-γ-Rhomboid質粒免疫組（IFN-γ-Rho組），兩個攻蟲對照組即PBS注射攻蟲組（PBS組）和pcDNA3.1空白質粒注射組（pcDNA組）和不攻蟲對照組（Control組）。在14及21日齡時，除Control組每只雞分別胸部肌肉注射

5、100μL PBS或100μg pcDNA3.1、pcDNA-Rhomboid或pcDNA-IFN-γ-Rhomboid，在28日齡時，感染組雛雞口服接種孢子化卵囊1×105個。分別在14、21、28、35及42日齡時，檢測每組雛雞淋巴細胞增殖功能、血清中抗Rhomboid IgG抗體變化及體增重變化，35日齡時，檢測各組的十二指腸病變計分、克糞便卵囊數(shù)量(OPG)值并計算抗球蟲指數(shù)(ACI)。結果表明，Rho組與IFN-γ-Rho組的