1型鴨肝炎病毒JX株基因組序列分析及VP0、VP1基因的原核表達(dá).pdf

1、隨著水禽養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，鴨病越來越受到重視，其中鴨病毒性肝炎是危害養(yǎng)鴨業(yè)的一種主要傳染病。有關(guān)DHV-1的分子生物學(xué)相關(guān)研究進(jìn)展緩慢，其基因組結(jié)構(gòu)和蛋白組成只是預(yù)測(cè)并且還存在差異，對(duì)病毒蛋白的功能研究國內(nèi)外還未見報(bào)道。本研究通過對(duì)DHV-1JX株進(jìn)行基因組序列的測(cè)定與分析，并對(duì)其編碼結(jié)構(gòu)蛋白的VP0和VP1基因進(jìn)行原核表達(dá)和免疫活性檢測(cè)，希望為DHV-1的診斷、分子流行病學(xué)研究和疫苗的研制提供科學(xué)依據(jù)。本研究主要完成了以下研究工作：

2、 (1)根據(jù)GenBank上已發(fā)表的DHV-1基因組序列設(shè)計(jì)9對(duì)互相重疊的特異性引物，以JX株RNA為模板，RT-PCR擴(kuò)增不同的目的基因，分別克隆到pMD18-T載體中，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆，對(duì)陽性克隆進(jìn)行測(cè)序，最后拼接出JX株基因組的核苷酸序列，得到7582bp核苷酸序列，并將JX株基因組序列提交到GenBank，登錄號(hào)為：EF093502?；蚪M序列包括5’-UTR的部分序列、3’-UTR的部分序

3、列和一個(gè)的ORF(長(zhǎng)6750bp，編碼一個(gè)含有2249個(gè)氨基酸的多聚蛋白)。基因組結(jié)構(gòu)為：5’UTR-VP0-VP3-VP1-2A1-2A2-2B-2C-3A-3B-3C-3D-3’UTR。 (2)運(yùn)用DNAStar軟件，對(duì)JX株基因組序列與GenBank上已發(fā)表的其他不同DHV-1毒株的基因組序列進(jìn)行同源性比較和遺傳進(jìn)化分析。結(jié)果表明，JX株與A66株(DQ886445)和C80株(DQ864514)的同源性為99.5％、親緣

4、關(guān)系最近，JX株與GenBank上已發(fā)表的其他DHV-1核苷酸序列的相似性都在94％以上，表明JX毒株與世界其他地方不同的DHV-1分離株之間，病毒基因組具有較高的同源性。 (3)根據(jù)DHV-1JX株基因組序列，設(shè)計(jì)含有BamHI和XhoI酶切位點(diǎn)的VP0基因引物，含有EcoRI和XhoI酶切位點(diǎn)的VP1基因引物，以JX株RNA為模板，RT-PCR擴(kuò)增VP0和VP1基因。將VP0和VP1基因分別克隆入原核表達(dá)載體pET-28a(

5、+)中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28-VP0和pET-28-VP1，隨后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入宿主菌E.coliBL21(DE3)中，用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE分析結(jié)果顯示重組融合蛋白VP0和VP1的分子量分別約為32kDa和30kDa?？扇苄苑治龃_認(rèn)重組VP0和VP1蛋白均主要以不溶性的包涵體形式存在。經(jīng)Western-blot分析證明重組VP0和VP1蛋白均具有良好的免疫學(xué)活性。 綜上所述，本研究對(duì)DHV-1JX株進(jìn)