淫羊藿苷促小鼠胚胎干細(xì)胞體外分化為心肌細(xì)胞的相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、胚胎干細(xì)胞(Embryonic stem cells，ES cells)是從早期胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)或桑椹胚分離后，能在體外長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)并保持高度未分化的全能細(xì)胞系。具有無(wú)限的分化潛能是其突出特點(diǎn)之一，即給予合適的培養(yǎng)條件，ES細(xì)胞可在體外分化為外、中、內(nèi)胚層的任何類型類細(xì)胞。研究證明。ES細(xì)胞體外向心肌細(xì)胞分化的特異基因表達(dá)圖式重演了體內(nèi)心肌發(fā)育基因表達(dá)，分化得到的心肌細(xì)胞具有體內(nèi)正常心肌或原代培養(yǎng)心肌的特征和功能. 在藥物研究領(lǐng)域，

2、該分化模型結(jié)合基因操作技術(shù)可成為心肌分化的動(dòng)態(tài)生理或病理模型，用以篩選治療心臟疾病藥物并研究藥物的作用機(jī)制。根據(jù)分化過(guò)程所體現(xiàn)的特點(diǎn)，該模型在藥物研究上的應(yīng)用主要有以下四個(gè)方面： (1)利用前體細(xì)胞篩選控制心肌分化的小分子藥物，發(fā)展有效誘導(dǎo)心肌分化的藥物； (2)利用前體細(xì)胞評(píng)價(jià)治療心臟疾病的潛在藥物； (3)利用分化成熟的心肌細(xì)胞設(shè)計(jì)潛在藥物； (4)進(jìn)行體外藥物胚胎毒性篩選，預(yù)測(cè)藥物的胚胎毒性。

3、 盡管關(guān)于藥物誘導(dǎo)ES細(xì)胞體外分化為心肌細(xì)胞的研究較少，本課題前期研究發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷(icariin，ICA)能夠有效促進(jìn)小鼠：ES細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞，表現(xiàn)為提高EBs的分化率，增強(qiáng)心肌特異性轉(zhuǎn)錄因子和心肌特異性基因的表達(dá)。ICA是小檗科(Berberidacae)淫羊藿屬(Epimedium)植物淫羊藿(Herba Epimedii)所含的一種黃酮苷類化合物，是該藥材的主要有效成分之一，其主要藥理活性在于改善心血管功能、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力

4、和激素水平等。 本研究主要目的是進(jìn)一步論證ICA的促分化作用，揭示其促心肌分化的深層次機(jī)制，為闡明其誘導(dǎo)分化藥理作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為發(fā)展其新的應(yīng)用提供理論依據(jù)。本研究前期工作已證明在ES細(xì)胞分化的第5天起，培養(yǎng)體系加入[CA，能有效促進(jìn)心肌分化。然而這種加藥時(shí)間覆蓋了分化發(fā)生和分化成熟兩個(gè)階段，模糊了藥物的最佳作用區(qū)間，因此本研究首先在分化的不同時(shí)相明確ICA作用區(qū)間(第一部分)，因?yàn)檎{(diào)節(jié)作用發(fā)生在不同分化階段的主導(dǎo)信號(hào)通路是存

5、在區(qū)別的。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步探索與ICA促分化作用有密切關(guān)系的信號(hào)通路(第二部分)。最后，本研究將探索ICA對(duì)心肌分化過(guò)程線粒體形成相關(guān)蛋白的影響(第三部分)。 1.ICA誘導(dǎo)小鼠ES細(xì)胞體外分化為心肌細(xì)胞的有效作用區(qū)間研究本研究采用經(jīng)典的懸滴分化培養(yǎng)法，評(píng)價(jià)ICA誘導(dǎo)ES細(xì)胞體外分化為心肌細(xì)胞的最佳作用時(shí)間。根據(jù)前期研究結(jié)果，分別在分化的第3-5 d，第5-8 d，第8-12 d加入10-7 mol/L，ICA。用倒置顯微鏡觀察

6、分化情況，以EB出現(xiàn)具有節(jié)律性收縮的心肌細(xì)胞團(tuán)為分化成功標(biāo)志，并根據(jù)EB內(nèi)出現(xiàn)心肌細(xì)胞團(tuán)的數(shù)量計(jì)算百分率并作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。采用免疫熒光法鑒定心肌特異性α-Actinin和Troponin-T表達(dá)，同時(shí)收集不同時(shí)段給藥后EB總蛋白進(jìn)行肌小節(jié)蛋白的檢測(cè)，進(jìn)一步確證ICA的最佳作用時(shí)間。 2.活性氧及其調(diào)控的MAPK家族激酶在ICA誘導(dǎo)心肌分化中的作用研究基于上述藥效學(xué)研究結(jié)果，為進(jìn)—步探索ICA誘導(dǎo)ES細(xì)胞體外分化為心肌細(xì)胞作用機(jī)制，

7、本研究著重探索了活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)通路及其調(diào)節(jié)的MAPK家族激酶在ICA促心肌分化過(guò)程中發(fā)揮的作用。分別采用流式細(xì)胞儀和熒光顯微鏡檢測(cè)了ICA對(duì)ES細(xì)胞和EBs內(nèi)ROS水平的影響，同時(shí)檢測(cè)NOX4的表達(dá)情況。另外在實(shí)驗(yàn)體系中共孵育抗氧化劑Trolox或NADPH酶抑制劑(Diphenyleneiodonium Chloride,DPI)后，重新評(píng)價(jià)ICA對(duì)EBs內(nèi)ROS水平的影響。Weste

8、rn-Blot檢測(cè)分化過(guò)程中和給藥后細(xì)胞內(nèi)p38MAPK、JNK以及ERK的磷酸化水平的變化，并觀察選擇性抑制p38MAPK、JNK及ERK后對(duì)ICA誘導(dǎo)ES細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞的影響。另外，在體系中共孵育DPI后，評(píng)價(jià)ICA的促分化作用和對(duì)D38MAPK的磷酸化的作用。最后采用Western-Blot法和免疫熒光法分析心肌特異性轉(zhuǎn)錄因子MEF-2C給藥前后在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)的分布情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，10-7 mol/L ICA與Es細(xì)胞孵

9、育3h后能顯著提高Es內(nèi)ROS的水平，該作用一直持續(xù)到6h開始有下降趨勢(shì)，到9h時(shí)回降至原始水平。ICA與EBs共孵育3h后能顯著提高EBs內(nèi)ROS水平，同時(shí)NOX4蛋白表達(dá)上調(diào)，說(shuō)明ICA能在信號(hào)源頭上增強(qiáng)ROS相關(guān)酶的表達(dá)，是一個(gè)長(zhǎng)時(shí)的作用。當(dāng)體系中共孵育抗氧化劑Trolox或NADPH酶抑制劑DPI時(shí)，ICA促EBs內(nèi)ROS產(chǎn)生的作用消失。 結(jié)果顯示在分化第5-7 d，p38MAPK、JNK以及ERK維持在一個(gè)較高的磷酸化

10、水平，之后有下降趨勢(shì)。當(dāng)ICA介入培養(yǎng)體系后，與對(duì)照組相比，p38MAPK的磷酸化水平顯著增強(qiáng)，維持時(shí)間延長(zhǎng)，并呈顯著的量效關(guān)系，而p-JNK及p- ERK的表達(dá)水平無(wú)明顯改變。分別對(duì)p38MAPK，JNK以及ERK進(jìn)行選擇性抑制后，發(fā)現(xiàn)p38MAPK抑制劑最能有效拮抗ICA的促分化作用，表現(xiàn)為降低分化率，減少心肌特異性基因α-MHC和MLC-2v表達(dá)，減少a-Actinin和Troponin-T表達(dá)。另外，NADPH酶抑制劑DPI能拮

11、抗ICA的促分化作用，并能抑制ICA引起的p38MAPK磷酸化水平升高。最后，結(jié)果尚顯示ICA在活化p38MAPK的同時(shí)增強(qiáng)了心肌特異性轉(zhuǎn)錄因子MeF2C在核內(nèi)的分布。 上述結(jié)果提示ROS的產(chǎn)生可能是ICA促分化作用的始發(fā)機(jī)制，ROS產(chǎn)生后激活p38MAPK，p38MAPK活化MEF2C并使之往核內(nèi)轉(zhuǎn)移，從而增強(qiáng)心肌特性基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，最終表現(xiàn)為促進(jìn)心肌的分化。 3.ICA對(duì)心肌分化過(guò)程中線粒體起源相關(guān)蛋白表達(dá)的影響基

12、于上述發(fā)現(xiàn)的p38MAPK在ICA促分化過(guò)程中的顯著作用，本部分實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟谔剿鱅CA促心肌分化過(guò)程中對(duì)線粒體形成相關(guān)蛋白PPARα及PGC-1α表達(dá)的影響，分為兩部分： (1)采用RT-PCR，Western-blot和免疫熒光共染法，檢測(cè)PPARa及其輔激活因子PGC-1α在分化過(guò)程的表達(dá)情況，選用PPARa抑制劑GW6471和激動(dòng)劑WY14643進(jìn)一步評(píng)價(jià)PPARa在分化過(guò)程中的作用： (2)評(píng)價(jià)ICA介入分化體系

13、后對(duì)PPARa及PGC-1a蛋白表達(dá)的影響，同時(shí)觀察選擇性抑制p38MAPK后對(duì)ICA促分化，PPARa及PGC-1a蛋白表達(dá)的影響，初步說(shuō)明該作用也是通過(guò)p38MAPK來(lái)實(shí)現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著分化時(shí)間的推移，特別是在第8 d，PGC-1a及PPARa的mRNA水平顯著上調(diào)。免疫印跡結(jié)果也證明PGC-1a及PPARa的蛋白表達(dá)在第8 d顯著增強(qiáng)，第10 d達(dá)到較高水平，之后變化不大。同時(shí)也檢測(cè)了心肌特異性基因α-MHC和MLC-2v和

14、肌小節(jié)結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)PGC-1a及PPARa的表達(dá)與α-MHC和MLC-2v的表達(dá)時(shí)間一致，而在標(biāo)志心肌成熟的肌小節(jié)結(jié)構(gòu)蛋白表達(dá)之前。免疫熒光共染色結(jié)果顯示Troponin-T陽(yáng)性區(qū)域(心肌細(xì)胞)PPARa的表達(dá)較強(qiáng)，且在分化早期，PPARa較多聚在細(xì)胞核。在分化的第5 d至第12 d加入PPARot特異性抑制GW6471能夠顯著抑制心肌的分化，表現(xiàn)為分化率的降低，α-MHC及MLC-2v基因表達(dá)以及α-Actinin及Tro

15、ponin-T蛋白表達(dá)減少，并存在明顯的量效關(guān)系，然而心肌特異性轉(zhuǎn)錄因子(GATA4，Nkx2.5及MEF2C)的表達(dá)并無(wú)明顯改變。另外，PPARa激動(dòng)劑WYl4643能夠有效促進(jìn)心肌的分化。以上結(jié)果提示PGC-1a及PPARa在心肌分化過(guò)程中有重要作用，作用時(shí)間可能在分化早期。 當(dāng)體系中加入10-7 mol/L ICA后，與陰性對(duì)照組比，PGC-1a及PPARta在mRNA和蛋白水平表達(dá)明顯增強(qiáng)，并呈一定量效關(guān)系。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，體

16、系中加入ICA后，p38MAPK的磷酸化水平顯著上調(diào)，特別是在分化的第6 d和第7 d，這與PGC-1a及PPARa的上調(diào)時(shí)間一致。另外，抑制p38MAPK既能抑制ICA的促分化作用，同時(shí)也抑制了ICA所增強(qiáng)的PGC-1a及PPARta蛋白表達(dá)。提示ICA的促分化作用可能與其誘導(dǎo)線粒體起源重要調(diào)節(jié)蛋白PGC-1a及PPARot有關(guān)，而該作用也是通過(guò)p38MAPK來(lái)實(shí)現(xiàn)的。 1.在ES細(xì)胞體外分化的第5-8d給予10-7mo1/L

17、ICA，最能有效誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞。 2.ROS及其介導(dǎo)的p38MAPK信號(hào)通路在ICA促心肌分化過(guò)程中發(fā)揮重要作用。在EBs向心肌細(xì)胞分化過(guò)程中，ICA能誘導(dǎo)NOX4表達(dá)而使內(nèi)源性ROS水平升高，ROS通過(guò)激活p38MAPK傳遞信號(hào)，活化了的p38MAPK繼而促使心肌特異性轉(zhuǎn)錄因子MEF2C往核轉(zhuǎn)移，從而增強(qiáng)了心肌特異基因a-MHC和MLC-2v的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，最終表現(xiàn)為促進(jìn)了心肌的分化。 3.ICA的誘導(dǎo)作用可能與其調(diào)