雞毒害艾美耳球蟲NA4基因免疫調(diào)節(jié)型DNA疫苗的構(gòu)建及其免疫保護(hù)性研究.pdf

1、雞球蟲病是危害養(yǎng)雞業(yè)健康發(fā)展的重要寄生蟲病之一，目前，雞球蟲病的防治仍主要依賴于化學(xué)藥物，但是抗藥性問(wèn)題和藥物殘留而引起的動(dòng)物源性食品安全問(wèn)題，給養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)的負(fù)面影響不容忽視，與傳統(tǒng)疫苗相比，核酸疫苗具有可靠的安全性、高穩(wěn)定性、能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生全面的免疫應(yīng)答等諸多優(yōu)勢(shì)。NA4基因是E.necatrix子孢子表面抗原基因序列，其重組蛋白對(duì)E.necatrix經(jīng)口感染雛雞能產(chǎn)生部分保護(hù)力。IFN-γ、IL-2主要由活化T細(xì)胞產(chǎn)生，有著廣泛的免

2、疫調(diào)節(jié)作用，在雞球蟲保護(hù)性免疫中起著重要作用。本研究將毒害艾美耳球蟲NA4基因單獨(dú)或與雞IFN-γ、IL-2基因融合克隆入pVAX1.0制備免疫調(diào)節(jié)型DNA疫苗，并用構(gòu)建的DNA疫苗免疫動(dòng)物，檢測(cè)對(duì)E.necatrix攻蟲的保護(hù)作用。 用柔嫩艾美耳球蟲子孢子表面抗原TA4基因特異性引物，以純化E.necatrix孢子化卵囊總RNA為模板，RT-PCR方法克隆出了一段新基因序列。該基因全長(zhǎng)747bp，共編碼248個(gè)氨基酸，與國(guó)外B

3、rothers從E.necatrix孢子化卵囊表面蛋白純化而得NA4基因同源性達(dá)到99.7％，與柔嫩艾美耳球蟲TA4基因同源性達(dá)到91.4％，擁有與柔嫩艾美耳球蟲TA4抗原基因相同序列的一段信號(hào)肽，推測(cè)該基因能夠誘導(dǎo)雞產(chǎn)生同時(shí)抗毒害艾美耳球蟲和柔嫩艾美耳球蟲的保護(hù)性免疫反應(yīng)。此基因已登錄GenBank，登錄號(hào)為EU523548。 將NA4基因克隆至質(zhì)粒表達(dá)載體pET-28a(+)，成功構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)-NA

4、4。用CaCl2法將其轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)菌E.Coli BL21，并用IPTG成功誘導(dǎo)了NA4重組抗原在大腸桿菌表達(dá)。經(jīng)SDS-PAGE分析其相對(duì)分子質(zhì)量約為26000KD。 利用DNA重組技術(shù)，分別構(gòu)建pVAX1.0-NA4、pVAX1.0-NA4-IFN-γ、pVAX1.0-NA4-IL-2 DNA疫苗。酶切鑒定正確后，分別用重組質(zhì)粒免疫14日齡雞，1周后取注射部位、非注射部位肌肉組織，用RT-PCR，Western-blot方法

5、檢測(cè)保護(hù)性抗原的表達(dá)情況。結(jié)果表明NA4基因、IFN-γ、IL-2基因均能在注射部位肌肉里成功表達(dá)。 NA4重組蛋白、重組質(zhì)粒pVAX1.0-NA4、pVAX1.0-NA4-IFN-γ、pVAX1.0-NA4-IL-2經(jīng)腿部肌肉分別于14、21日齡兩次免疫雛雞，并設(shè)立感染非免疫和非感染非免疫對(duì)照。28日齡經(jīng)口接種新鮮的E.necatrix孢子化卵囊，一周后宰殺全部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，進(jìn)行小腸病變計(jì)分、盲腸內(nèi)容物卵囊數(shù)、增重和抗球蟲指數(shù)四