棉酚對人與大鼠11βHSD、3βHSD及17βHSD3抑制作用的研究.pdf

1、目的： 1.根據(jù)11βHSD在糖皮質(zhì)激素的代謝中的作用，探究棉酚作為男性避孕藥引起低血鉀的機制。 2.分析棉酚對映體是否可以通過抑制3β-HSD與17β-HSD3從而抑制雄激素的合成，及其用于轉(zhuǎn)移性前列腺癌治療的可能性。 方法： 用CO2窒息處死大鼠，并在無菌條件下取出肝臟、睪丸，以BSA濃度梯度離心法將一部分大鼠睪丸分離Leydig細胞制成細胞懸液，另一部分勻漿進行微粒體制備，以Bio-Rad蛋白測定試

2、劑盒測定濃度。(人睪丸及肝微粒體均為成品)。細胞懸液及微粒體懸液均與棉酚孵育觀察其抑制作用。 1.棉酚對11βHSD的活性抑制 完整Leydig細胞與棉酚預(yù)孵育2min然后將加入[1，2-3H]CORT或[1，2-3H]11DHC測定11βHSD1氧化酶或者還原酶的活性。肝腎微粒體與底物、NADP+(11βHSD1氧化酶活性)或NADPH加葡萄糖-6-磷酸酶(測11βHSD1還原酶活性)或者NAD+(測11βHSD2活性

3、)一起孵育。使用薄層色譜分離法分離類固醇。CORT轉(zhuǎn)化為11DHC和11DHC轉(zhuǎn)化為CORT的百分率通過鑒定為11DHC或者CORT的放射活性計數(shù)除以CORT加11DHC的總數(shù)。 2.棉酚對3β-HSD與17β-HSD3的活性抑制： 在不同濃度(+)-或(-)-棉酚內(nèi)加入人和大鼠的睪丸微粒體蛋白及輔酶Ⅰ或輔酶Ⅱ進行反應(yīng)以測定棉酚各對映體的半數(shù)抑制濃度。為了確定棉酚對映體的抑制模式，不同濃度的DIONE或PREG及輔酶Ⅰ或

4、輔酶Ⅱ加入含有睪丸微粒體和各棉酚對映體的反應(yīng)混合液(PBS緩沖液)中進行反應(yīng)。為了確定棉酚的抑制模式是否是通過與輔酶Ⅰ或輔酶Ⅱ競爭而實現(xiàn)，不同濃度的輔酶Ⅰ及PREG或輔酶Ⅱ及DIONE加入含有睪丸微粒體和各棉酚對映體的PBS反應(yīng)混合液中。使用薄層色譜分離法分離類固醇。PREG或DIONE轉(zhuǎn)換為PO或T的百分率通過鑒別為PO或T的放射活性計數(shù)除以總計數(shù)包括PREG及PO或DIONE及T計算。 結(jié)果： 1.無論(+)-棉酚還

5、是(-)-棉酚都顯示了對11βHSD2強烈的抑制，半數(shù)抑制濃度分別為大鼠(+)-棉酚0.61μM；(-)-棉酚1.33μM，人(+)棉酚1.05μM；(-)-棉酚1.90μM。棉酚對11βHSD1的抑制較弱，消旋體棉酚的半數(shù)抑制濃度≥100μM。棉酚引起的低血鉀極可能與其強烈抑制11βHSD2有關(guān)。 2.與人體相比，棉酚對映體可以明顯抑制大鼠3β-HSD，其半數(shù)抑制濃度為0.2μM，而人3β-HSD的IC50為3～5μM。但是跟

6、大鼠相比，人17β-HSD3對棉酚對映體更為敏感，IC50分別為：人體(-)棉酚0.36±0.09，(+)棉酚1.13±0.12，大鼠(-)棉酚3.43±0.46，(+)棉酚10.93±2.27。對于17β-HSD3抑制的敏感性方面存在種屬和對映體的差異。棉酚對映體通過與這些酶的輔因子結(jié)合位點競爭均顯示了對3β-HSD與17β-HSD3的競爭性抑制作用。 結(jié)論： 1.棉酚引起的低血鉀極可能與(+)-棉酚抑制11βHSD2