人腎上腺H295R細胞中OrexinA調(diào)節(jié)3β-HSD的分子機制研究.pdf

1、背景：增食欲素(orexin)是1998年發(fā)現(xiàn)的一種神經(jīng)肽，分為均來自于同一前體的orexinA及orexinB。orexin及其受體廣泛并有差異的分布于腦組織中，同時也表達于腎臟、甲狀腺、睪丸、卵巢、空腸、肺等外周組織里，參與調(diào)節(jié)了多種生理功能，包括食欲、能量代謝、睡眠覺醒、生長、神經(jīng)內(nèi)分泌、生殖系統(tǒng)功能等，這些功能由結(jié)合兩種G蛋白偶聯(lián)受體——orexin受體1(OX1R)及orexin受體2來實現(xiàn)。
　　最近的研究指出orex

2、in能夠與HPA軸相互作用，影響糖皮質(zhì)激素的釋放、腎上腺皮質(zhì)細胞增殖以及多種腎上腺皮質(zhì)的鹽皮質(zhì)激素的釋放。3-β羥基類固醇脫氫酶(3β-HSD)在糖皮質(zhì)激素合成中至關(guān)重要，不僅存在于腎上腺皮質(zhì)、性腺和胎盤，而且也存在于肝等幾乎所有的周圍組織中，并在不同的組織中具有不同的生物活性。有報道稱orexinA能夠刺激H295R細胞的糖皮質(zhì)激素分泌，并且這個升高伴隨著3β-HSD的mRNA的高表達，但其中涉及的細胞通路機制仍所知甚少。
　　

3、盡管近年來關(guān)于orexin及其受體的研究逐漸深入，其激活人腎上腺MAPK級聯(lián)的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的確切機制尚屬未知。因此，本研究旨在用多能腎上腺H295R細胞系驗證orexinA的效應(yīng)并進一步闡明orexin受體A在MAPK通路上的激活機制，相信這對于加深對orexin系統(tǒng)細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)通路成分的了解有所裨益。
　　實驗方法：
　　體外培養(yǎng)人腎上腺H295R細胞，分別加入不同濃度的orexinA和/或OX1R特異性抑制劑(SB3348

4、67)，western-blot技術(shù)檢測細胞蛋白表達;MTT法檢測H295R細胞增殖;凋亡試劑盒檢測H295R細胞凋亡。其后分別加入SB334867和/或ERK1/2或p38特異性拮抗劑進行干預(yù)，western-b1ot檢測ERK1/2及p38磷酸化蛋白的水平。
　　實驗結(jié)果：
　　orexinA對H295R細胞增殖的影響:用不同濃度的orexinA培育H295R細胞后檢測增殖均有所增加，這種增加可以被OX1R特異性拮抗劑、

5、ERK1/2特異性拮抗劑、p38特異性拮抗劑或其二者聯(lián)合所削弱。
　　orexinA對H295R細胞凋亡的影響:用不同濃度的orexinA培育H295R細胞后檢測凋亡均被抑制，這種抑制效果可以被OX1R特異性拮抗劑、ERK1/2特異性拮抗劑、p38特異性拮抗劑或其二者聯(lián)合所削弱。
　　orexinA對H295R細胞中OX1R蛋白活性的影響:用不同濃度的orexinA(10-10M，10-8M，and10-6M)培育H295R

6、細胞后檢測OX1R蛋白的磷酸化水平，結(jié)果均有所上調(diào)，其中10-6M濃度下上調(diào)達最高。
　　orexinA對H295R細胞中3β-HSD蛋白活性的影響:用不同濃度的orexinA培育H295R細胞后檢測3β-HSD蛋白的磷酸化水平均上調(diào)，這種上調(diào)可以被OX1R特異性拮抗劑、ERK1/2特異性拮抗劑、p38特異性拮抗劑或其二者聯(lián)合所削弱。
　　orexinA對H295R細胞調(diào)節(jié)所涉及的信號通路:用不同濃度的orexinA培育H2