HPV16型L2全長及其氨基端(1-200)原核融合蛋白的表達(dá)和交叉反應(yīng)特性研究.pdf

1、目的：
　　 1．利用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建HPV16型L2全長基因重組質(zhì)粒并進(jìn)行原核表達(dá)和鑒定，進(jìn)一步通過動物免疫及與其它HPV型別間(6、11、16和18型)的交叉反應(yīng)特性等分析，對HPV16型L2全長原核融合蛋白的免疫原性和抗原性進(jìn)行了初步研究。
　　 2．采用生物信息學(xué)軟件，對HPV共40種型別的L2氨基酸序列進(jìn)行同源性分析，篩選出在臨床感染常見的HPV6、11、16、18、31、33等14種型別間具有高度保守性的氨

2、基端序列，即HPV L2氨基端(1-200)，并通過分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建并表達(dá)該段序列的融合蛋白，經(jīng)Western blot分析其蛋白在臨床最常見HPV感染型別間(6、11、16和18型)的交叉反應(yīng)特性。
　　 3．通過ELISA方法檢測分析宮頸癌及尖銳濕疣患者血清中HPV16 L2全長及其氨基端(1-200)的特異性抗體，進(jìn)一步分析上述兩種蛋白作為通用型ELISA抗原試劑，對臨床常見HPV型別感染患者血清學(xué)診斷的敏感性和特異性。

3、
　　 方法：
　　 1．采用PCR法從宮頸癌患者組織DNA中擴(kuò)增HPV16 L2全長基因，將其克隆至原核表達(dá)載體PGEX-4T-1中，構(gòu)建重組質(zhì)粒PGEX-4T-1-HPV16 L2，并于L2的C-末端引入6×His標(biāo)簽，以利于蛋白純化。將鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3)中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)HPV16 L2蛋白，經(jīng)SDS-PAGE和Western blot方法鑒定；
　　 2．經(jīng)鎳螯合

4、親和層析柱(Ni-NTA Agarose)純化HPV16 L2全長融合蛋白，經(jīng)佐劑乳化后，采用背部皮下多點注射免疫日本大耳白家兔，間隔2周免疫，共3次，并分別于免疫前和每次免疫后1周取兔血清，檢測兔免疫血清抗體IgG；進(jìn)一步采用Western blot檢測制備的血清抗體與HPV16 L2全長蛋白的結(jié)合特異性，同時采用ELISA法檢測兔血清抗體水平及各周抗體滴度的變化趨勢。
　　 3．進(jìn)一步通過WB檢測HPV16 L2全長融合蛋白

5、與HPV6、11、16和18型DNA檢測陽性的患者血清特異性結(jié)合能力。收集108例尖銳濕疣患者、156例宮頸癌患者和100例健康對照者血清，以Ni-NTA Agarose純化的HPV16 L2全長融合蛋白作為包被抗原，采用間接ELISA法檢測標(biāo)本中的HPV血清特異性IgG抗體，并分析了該蛋白在檢測HPV感染的宮頸癌及尖銳濕疣患者血清特異性抗體的敏感性和特異性。
　　 4．采用DNASTAR軟件，對HPV共40種型別的L2氨基酸序

6、列進(jìn)行同源性分析，篩選出臨床常見的HPV6、11、16、18、31、33等14種型別間具有高度保守性的L2氨基端(1-200)，并通過分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建和表達(dá)該段序列的原核融合蛋白，并經(jīng)SDS-PAGE和WB方法鑒定。
　　 5．采用WB方法分析(1-200)原核蛋白在臨床最常見HPV感染型別(6、11、16、18型)間的交叉反應(yīng)特性；同時收集98例尖銳濕疣患者、135例宮頸癌患者和96例健康對照者血清，通過ELISA．方法檢測

7、標(biāo)本中的HPV血清特異性IgG抗體，并分析該蛋白在檢測HPV感染的宮頸癌及尖銳濕疣患者血清特異性抗體的敏感性和特異性。
　　 結(jié)果：
　　 1．成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒PGEX-4T-1-HPV16 L2，并較高效地表達(dá)了含有HPV16L2全長基因的原核融合蛋白，其表達(dá)量占總蛋白的27．2％；SDS-PAGE和WB檢測結(jié)果顯示在相對分子質(zhì)量約82x103Da處可見特異性陽性信號條帶。
　　 2．采用HPV16 L2全長

8、融合蛋白免疫家兔，在全程免疫后產(chǎn)生了高效價的HPV16 L2特異性抗體，最高滴度達(dá)1：256000。通過WB檢測該抗體可與HPV16 L2融合蛋白在相對分子質(zhì)量約82x103Da處可見特異性陽性信號條帶。
　　 3．以HPV6、11、16和18 DNA陽性患者血清為一抗的WB結(jié)果顯示，HPV16 L2全長融合蛋白在相對分子質(zhì)量82x103Da處均出現(xiàn)特異性陽性信號條帶。ELISA結(jié)果顯示，尖銳濕疣組、宮頸癌組和健康對照組血清抗體

9、吸光度值(A)分別為0．825±0．409、0．808±0．376、0．128±0．15，陽性率分別為92．6％、92．3％和6．0％。3組間血清抗體A值及陽性率差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(H=207．292，x2=251．846，P均<0．01)，而尖銳濕疣組與宮頸癌組比較無顯著性差異(P>0．05)?；谠摰鞍椎腅LISA用于檢測尖銳濕疣組敏感度為92．6％(100/108)，特異度為94．0％(94/100)，對于宮頸癌組診斷的敏感度為

10、92．3％(144/156)，特異度為94．0％(94/100)。
　　 4．采用DNASTAR軟件，對HPV共40種型別的L2氨基酸序列進(jìn)行比對分析，進(jìn)而篩選出在HPV6、11、16、18、31、33、35、45、52、58、59、66、68、73型別間均具有較高同源性的氨基酸區(qū)域，即HPV L2 N端1-200氨基酸序列，上述各型間L2的1-200序列氨基酸與HPV16型相比一致性達(dá)52．7％~74．3％。通過分子生物學(xué)技術(shù)

11、成功構(gòu)建并表達(dá)了含有HPV16 L2氨基端(1-200)氨基酸序列的融合蛋白。
　　 5．經(jīng)WB分析HPV16 L2(1-200)融合蛋白在臨床最常見HPV6、11、16、18感染型別間具有良好的交叉識別特性。ELISA結(jié)果顯示，該蛋白在檢測尖銳濕疣組、宮頸癌組和健康對照組血清IgG抗體值分別為(0．753±0．262)、(0．756±0．274)和(0．158±0．124)，三組間的A值比較具有顯著性差異(H=216．351，

12、P<0.01)，而尖銳濕疣組與宮頸癌組比較無顯著性差異(P>0．05)；三組的血清抗體陽性率分別為89．8％(88/98)、88．9％(120/135)和9．3％(9/96)，三組間血清抗體陽性率比較具有顯著性差別(x2=193．302，P<0．01)，而尖銳濕疣組與宮頸癌組比較無顯著性差異(P>0．05)。基于該蛋白的ELISA血清學(xué)抗體檢測，對尖銳濕疣診斷的敏感性為89．7％(88/98)，特異性為90．6％(87/96)，對宮頸癌

13、組診斷的敏感性為88．8％(120/135)，特異性為90．6％(87/96)。
　　 結(jié)論：
　　 1．采用PGEX-4T-1表達(dá)載體成功構(gòu)建并表達(dá)了未經(jīng)密碼子優(yōu)化的HPV16 L2全長基因的融合蛋白；可通過親和層析法純化了引入6×His標(biāo)簽的HPV16L2融合蛋白，同時經(jīng)過WB和ELISA檢測結(jié)果提示該蛋白的抗原性未受影響。
　　 2．通過原核HPV16 L2全長蛋白抗原免疫家兔，可成功制備高效價的特異性血清

14、抗體，為HPV L2抗原的免疫學(xué)的初步研究提供了實驗基礎(chǔ)。
　　 3．經(jīng)WB結(jié)果提示，HPV16 L2全長蛋白可在臨床常見高危型和低危型別即HPV16、18和6、11這4個型別間產(chǎn)生交叉識別反應(yīng)。經(jīng)ELISA檢測提示，該蛋白作為ELISA診斷試劑抗原在檢測尖銳濕疣及宮頸癌患者血清HPV特異性抗體中均具有較高的敏感性和特異性。
　　 4．采用生物信息學(xué)方法，獲得了具有較高保守性的HPV L2氨基端(1-200)的氨基酸序列

15、，該段序列在臨床常見HPV型別間(HPV6、11、16、18、31、33、35、45、52、58、59、66、68、73型)具有較高的同源性。通過原核表達(dá)載體PGEX-4T-1可以較高效地表達(dá)HPV16 L2(1-200)氨基酸序列。
　　 5．WB結(jié)果表明HPV16 L2(1-200)融合蛋白在臨床最常見HPV6、11、16、18型別的感染血清中具有良好的交叉反應(yīng)。ELISA結(jié)果顯示，該蛋白作為ELISA診斷試劑抗原在檢測尖銳