NF-κB和AP-1參與低氧誘導大鼠CRHR1基因轉錄調節(jié).pdf

1、低氧應激是應激的重要形式之一。為適應低氧環(huán)境、進行自我保護，機體形成了在不同氧環(huán)境下的基因表達調控機制。促腎上腺皮質激素釋放激素(Corticotropin-releasinghormone，CRH)家族在機體低氧應激過程中通過調節(jié)下丘腦-垂體-腎上腺皮質(hypothalamuspituitaryadrenal，HPA)軸、神經(jīng)內分泌系統(tǒng)、自主神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)功能，參與調節(jié)機體的低氧應激過程，進而穩(wěn)定機體內環(huán)境。促腎上腺皮質激素釋放

2、激素1型受體(Corticotropinreleasinghormonereceptor1，CRHR1)介導CRH生理作用的發(fā)揮，其基因表達調控是應激誘導HPA軸反應的關鍵環(huán)節(jié)。我們實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)低氧應激激活HPA軸，誘導大鼠等動物腦不同部位以及腺垂體CRHR1mRNA表達上調，提示低氧下轉錄因子可能通過與其作用元件結合，在轉錄水平調控CRHR1mRNA的表達。本研究旨在探討低氧應激下NF-κB和AP-1參與CRHR1轉錄調節(jié)的機制

3、。
　　 研究方法
　　 將大鼠垂體CRHR1基因5’調控區(qū)-2161～+347段不同長度DNA序列亞克隆入不含啟動子的螢光素酶載體pGL3中，構建各種質粒，轉染AtT20細胞，檢測其活性與內參pRL-TK螢光素酶活性比值；利用整體間歇低氧應激動物模型，研究低氧誘導大鼠垂體CRHR1基因表達變化；應用EMSA方法檢測轉錄因子在體外與靶序列結合活性；應用定量RealtimePCR方法檢測整體水平CRHR1mRNA的表達。<

4、br>　　 研究結果如下：
　　 1.獲得大鼠垂體CRHR1基因5’調控區(qū)-2161～+347段DNA序列，全長為2508bp，經(jīng)過生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)該序列分別含有5個c-jun/AP-1，3個GR，4個NF-κB以及8個HIF-1結合位點。
　　 2.成功構建質粒p2161-18T和p2161Luc，分別用于測序和檢測CRHR1基因5’端調控區(qū)轉錄活性。根據(jù)轉錄因子結合元件在CRHR1基因5'調控區(qū)-2161～+3

5、47段的分布，又分別構建了p1833Luc、p1795Luc、p1692Luc、p1289Luc、p1248Luc、p1218Luc、p1140Luc、p838Luc、p687Luc、p360Luc等系列缺失體質粒。進一步構建了含-809～-800位點的NF-κB結合元件的突變體質粒p838mLuc和含有-1277～1271位點的c-jun/AP-1結合元件的突變體質粒p1289mLuc和以及c-jun的真核表達質粒pcDNA3.1-c

6、-jun。
　　 3.發(fā)現(xiàn)p2161Luc、p1289Luc、p838Luc在AtT20細胞中的活性隨低氧時間延長而呈現(xiàn)增強的趨勢，在24小時達到最大值。p2161Luc和p1289Luc的活性在低氧暴露8-12小時期間曲線平緩。
　　 4.發(fā)現(xiàn)低氧暴露24小時，p838Luc在AtT20細胞中的活性與常氧對照組相比顯著增強，這一現(xiàn)象可以被NF-κB抑制劑(PDTC)抑制；而突變體p838mLuc活性無明顯增強。大鼠垂體

7、CRHR1基因5’調控區(qū)-809～-800區(qū)域的結合元件在體外能與AtT20細胞以及大鼠垂體的核蛋白中的NF-κB結合，且低氧進一步增強二者結合活性，此結合可以被PDTC、p65抗體、100倍濃度的冷探針消除；突變探針(-809～-800)不再與NF-κB結合。在整體低壓艙模擬5km間歇低氧(10.8％O2，4h/d)條件下，CRHR1mRNA表達表現(xiàn)為一個先下降后增強的過程，在第2天表達顯著下降，第5天表達上升，二者均可被PDTC反轉

8、；7km(7.8%O2)連續(xù)低氧8h，CRHR1mRNA表達下降幅度更大，此結果同樣可被PDTC反轉。
　　 5.發(fā)現(xiàn)大鼠垂體CRHR1基因5’調控區(qū)-1277～1271區(qū)域的結合元件在體外能與AtT20細胞核蛋白中的c-jun/AP-1結合，低氧暴露進一步增強二者結合活性，此結合可以被c-jun磷酸化抗體、100倍濃度的冷探針消除。突變探針(-1277～1271)不再與c-jun/AP-1結合。p1289Luc轉染AtT20細

9、胞，低氧暴露24h后，CRHR1基因5'調控區(qū)-1289～+347段的轉錄活性較常氧對照組增幅達到最大，此增幅可以被2μgpcDNA3.1-c-jun的共表達完全抑制。
　　 結論
　　 1.CRFR1基因5'調控區(qū)-2161～+347參與低氧上調CRFR1基因轉錄。
　　 2.證明了大鼠垂體CRHR1基因5’調控區(qū)-809～-800位點的NF-κB結合元件促進低氧誘導的大鼠垂體CRHR1基因的轉錄。