NF-κB參與低氧預(yù)適應(yīng)對(duì)自體原位肝移植大鼠JNK通路的影響.pdf

1、1、目的：本實(shí)驗(yàn)采用自制的“經(jīng)門靜脈灌注法自體原位肝移植模型”，術(shù)前予大鼠低氧預(yù)適應(yīng)(hypoxia preconditioning，HP)處理，通過觀察術(shù)后不同時(shí)段肝組織丙二醛、超氧化物歧化酶水平及相應(yīng)肝功能的變化；細(xì)胞色素C、Cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)；肝組織p-C-JUNmRNA、NF-κB mRNA含量；肝臟光鏡、電鏡下的改變；研究低氧預(yù)適應(yīng)作用后肝細(xì)胞凋亡改變，并分析肝臟缺血再灌注損傷過程中NF-κB在JNK信

2、號(hào)傳導(dǎo)通路調(diào)節(jié)肝細(xì)胞凋亡中的作用；更進(jìn)一步的探索低氧預(yù)適應(yīng)法減輕肝細(xì)胞凋亡的確切機(jī)制。
　　 2、方法：
　　 2.1將96只SD大鼠，雌雄不拘，以簡單隨機(jī)化法均分為3組：①正常對(duì)照組(NC)：僅進(jìn)腹分離不夾閉血管，不作其他處理。②自體移植組(AT)：行自體原位肝移植。③低氧預(yù)適應(yīng)組(HP)：移植前用體積分?jǐn)?shù)8％氮氧混合氣體行低氧預(yù)處理90 min，然后行自體原位肝移植。
　　 2.2各組大鼠均在術(shù)后1、2、12

3、、24h處死，經(jīng)腔靜脈采血3ml檢測(cè)血清ALT、AST水平，硫代巴比妥酸比色法、黃嘌呤氧化酶法分別檢測(cè)大鼠肝組織超氧化物歧化酶、丙二醛水平，免疫組織化學(xué)染色法測(cè)定細(xì)胞色素C表達(dá)，Western blot法檢測(cè)Cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)，RT-PCR檢測(cè)p-C-JUN mRNA、NF-κB mRNA水平，并在光學(xué)顯微鏡、透射電子顯微鏡下觀察各組肝細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。
　　 3、結(jié)果：
　　 3.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量分

4、析
　　 所有大鼠均進(jìn)入結(jié)果分析，每組32只，各組1，2，12，24 h每個(gè)時(shí)間段各取8只檢測(cè)。移植成功的標(biāo)準(zhǔn)是移植結(jié)束后，大鼠即刻蘇醒，翻身，并能維持有效呼吸、心跳。
　　 3.2各組大鼠術(shù)后不同時(shí)相點(diǎn)血清ALT和AST水平比較
　　 低氧預(yù)適應(yīng)組的血清ALT和AST水平顯著低于自體移植組組，但均顯著高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)
　　 3.3各組大鼠術(shù)后不同時(shí)相點(diǎn)肝組織超氧化物歧化酶

5、、丙二醛水平的變化
　　 與對(duì)照組比較，兩移植組各時(shí)相的肝組織丙二醛水平升高，超氧化物歧化酶水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與自體移植組比較，低氧預(yù)適應(yīng)組肝組織丙二醛水平顯著降低、超氧化物歧化酶水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)
　　 3.4各組大鼠術(shù)后不同時(shí)相點(diǎn)肝組織細(xì)胞色素C蛋白的表達(dá)
　　 低氧預(yù)適應(yīng)組各時(shí)段細(xì)胞色素C蛋白陽性表達(dá)明顯低于自體移植組，但均顯著高于正常對(duì)照組，差異有

6、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)
　　 3.5各組大鼠術(shù)后不同時(shí)相點(diǎn)肝臟組織中Cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)情況
　　 各時(shí)相自體移植組和低氧預(yù)適應(yīng)組Cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)水平較正常對(duì)照組顯著升高(P<0.05)，術(shù)后12 h達(dá)到峰值，低氧預(yù)適應(yīng)組Cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)水平較自體肝移植組顯著下降(P<0.05)。
　　 3.6各組大鼠術(shù)后不同時(shí)相點(diǎn)肝臟組織中p-C-J

7、UN mRNA表達(dá)情況
　　 p-C-JUN rnRNA表達(dá)水平于術(shù)后1 h即開始升高，2 h達(dá)到峰值，隨后下降。術(shù)后1h、2h、12h自體移植組和低氧預(yù)適應(yīng)組p-C-JUN mRNA表達(dá)水平較正常對(duì)照組顯著升高(P<0.05)，低氧預(yù)適應(yīng)組p-C-JUN mRNA表達(dá)水平較自體肝移植組顯著下降(P<0.05)；術(shù)后24h p-C-JUN mRNA表達(dá)水平3組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　 3.7各組大

8、鼠術(shù)后不同時(shí)相點(diǎn)肝組織NF-κB mRNA的含量
　　 NF-κB mRNA含量于移植后1 h即開始升高，12 h達(dá)到峰值，隨后數(shù)值下降，與正常對(duì)照組比較，兩移植組各時(shí)相肝組織NF-κB mRNA含量顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與自體移植組比較，低氧預(yù)適應(yīng)組肝組織NF-κB mRNA含量顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)
　　 3.8各組大鼠術(shù)后肝組織顯微結(jié)構(gòu)的變化光鏡下，自體肝移植組各時(shí)段中

9、央靜脈周圍的肝細(xì)胞明顯腫脹，肝血竇變窄，而肝細(xì)胞之間的間隙變寬。低氧預(yù)適應(yīng)組的肝小葉結(jié)構(gòu)基本正常，肝組織無明顯改變。
　　 3.9各組大鼠術(shù)后肝組織超微結(jié)構(gòu)的變化
　　 自體移植組1h時(shí)段的肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)未見明顯改變；2h時(shí)段，肝細(xì)胞間隙變大，線粒體腫脹明顯；12h段肝細(xì)胞濃縮，可見細(xì)胞核裂解，染色質(zhì)粗糙，核仁濃縮，線粒體嵴疏松溶解，雙層膜模糊不清；24h時(shí)段，肝細(xì)胞呈現(xiàn)固縮死亡的形態(tài)，染色質(zhì)邊集，少數(shù)肝細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)凋亡小