IGFBP7在結(jié)直腸癌細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)研究.pdf

1、結(jié)直腸癌是嚴(yán)重危害人類健康的惡性腫瘤之一.諸多類型腫瘤中,結(jié)直腸癌的分子機(jī)理研究開展比較早,研究得相對比較清楚.自Vogelstein提出經(jīng)典的結(jié)直腸癌的多步驟、多基因的發(fā)生發(fā)展模式以來,結(jié)直腸癌的分子病理學(xué)在不斷發(fā)展,一系列與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展有關(guān)的基因被相繼發(fā)現(xiàn).近二十年來,隨著我國居民生活方式和飲食結(jié)構(gòu)的改變,結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率呈現(xiàn)上升的趨勢,積極開展對結(jié)直腸癌相關(guān)分子的尋找,并進(jìn)行功能研究,明確其在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的確切作

2、用及其相關(guān)分子機(jī)制,對尋找結(jié)直腸癌的診斷、治療、預(yù)后靶標(biāo)有很重要的意義. 結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展是個(gè)多步驟的過程,其中從正常粘膜-腺瘤-癌變途徑是最重要的發(fā)生模式,探索上述過程中的基因表達(dá)改變對于加深我們對結(jié)直腸癌機(jī)理的認(rèn)識有著重要意義.我們實(shí)驗(yàn)室于1999年原創(chuàng)性地運(yùn)用抑制性差減雜交法建立了三個(gè)結(jié)直腸癌相關(guān)差減文庫:腺癌相對腺瘤(T-A)、腺癌相對正常粘膜(T-N)、腺瘤相對正常粘膜(A-N),從中篩選出一系列在結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展

3、過程中差異表達(dá)的基因,并進(jìn)行后續(xù)的深入研究. 胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白7)是在F-N文庫中篩選頻率較高、在腺癌中高表達(dá)的一個(gè)基因.我們前期運(yùn)用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)法和免疫組化法檢測證實(shí)IGFBP7mRNA以及蛋白水平在結(jié)直腸癌組織中高表達(dá),但在結(jié)直腸癌細(xì)胞系卻是低表達(dá),在所檢測的SW480、SW620、HT29、RKO、SW1116、HCT8、COLO205、Caco2、CW2、Hce8693中,IGFBP7只在SW480與Ca

4、co2細(xì)胞系中表達(dá)陽性.這個(gè)矛盾現(xiàn)象也給這個(gè)基因在結(jié)直腸癌里的真正作用添加了神秘色彩.本課題旨在通過兩部分工作的研究:IGFBP7在結(jié)直腸癌細(xì)胞的生物學(xué)功能以及其引起的效應(yīng)分子改變,明確其在結(jié)直腸癌中的生物學(xué)效應(yīng). IGFBP7在結(jié)直腸癌細(xì)胞系的低表達(dá)現(xiàn)象給了我們一個(gè)思路:將IGFBP7cDNA轉(zhuǎn)染到不表達(dá)內(nèi)源性IGFBP7的結(jié)直腸癌細(xì)胞中會產(chǎn)生怎樣的變化?我們選用了具備不同遺傳學(xué)背景的兩株不表達(dá)內(nèi)源性IGFBP7的RKO,SW

5、620細(xì)胞作為我們的細(xì)胞模型.我們構(gòu)建了PcDNA3.1真核表達(dá)載體,將其轉(zhuǎn)染到RKO與SW620細(xì)胞,RT-PCR以及細(xì)胞分泌上清western blot證實(shí)了IGFBP7的表達(dá).然后我們對其一系列生物學(xué)效應(yīng)進(jìn)行了檢測分析.包括細(xì)胞生長實(shí)驗(yàn)、軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)、凋亡相關(guān)檢測. 細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8分析顯示:IGFBP7可以抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的生長.IGFBP7-RKO,IGFBP7-SW620的轉(zhuǎn)染株的生長速度要明顯慢于轉(zhuǎn)染空載體

6、對照組.我們還比較了同一病人來源卻具有不同IGFBP7表達(dá)譜的兩株細(xì)胞SW480(來自原發(fā)灶,IGFBP7陽性)與SW620(來自轉(zhuǎn)移灶,IGFBP7陰性)的生長速率.結(jié)果顯示:IGFBP7陽性的SW480細(xì)胞的生長速率要明顯慢于IGFBF7陰性SW620(p=0.0108). 軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示:IGFBP7可以降低RKO與SW620的軟瓊脂克隆形成能力.細(xì)胞鋪板軟瓊脂孵育三周后,我們進(jìn)行>100μm克隆計(jì)數(shù).IGFBP7

7、-RKO VS對照:平均12VS 59,p=0.0004;IGFBP7-SW620 VS對照:平均18 VS 55,p=0.0026.同時(shí),我們也觀察到IGFBP7轉(zhuǎn)染株的克隆要比對照組小,這也證實(shí)了我們上述關(guān)于IGFBP7是抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞生長的結(jié)果.我們注意到,RKO細(xì)胞IGFBP7轉(zhuǎn)染株與對照株的克隆大小差異更明顯,這可能與兩株細(xì)胞的基礎(chǔ)背景特點(diǎn)不同有關(guān).具體機(jī)理還有待深入研究. 碘化丙錠(propidium iodide

8、,PI)單染,PI/Annexin V雙染的流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染IGFBP7 48小時(shí),細(xì)胞出現(xiàn)sub-G1峰,Annexin V陽性率增加,透射電鏡對細(xì)胞內(nèi)部形態(tài)的觀察顯示:轉(zhuǎn)染IGFBP7以后,細(xì)胞出現(xiàn)核皺縮、染色質(zhì)邊聚的趨勢,提示IGFBP7誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡.免疫印跡顯示IGFBP7在RKO細(xì)胞中可以引起Caspase-3表達(dá)增高,提示Caspase-3相關(guān)途徑可能是IGFBP7在結(jié)直腸癌細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡的關(guān)鍵途徑. 我們發(fā)現(xiàn)

9、的IGFBP7對結(jié)直腸癌細(xì)胞的生長抑制作用與其它實(shí)驗(yàn)室報(bào)道的該蛋白對其它腫瘤細(xì)胞,包括乳腺癌細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞、宮頸癌細(xì)胞、骨肉瘤細(xì)胞等的生長抑制作用是相一致的.結(jié)合我們實(shí)驗(yàn)室近期關(guān)于結(jié)直腸癌組織中IGFBP7的表達(dá)與預(yù)后生存分析的結(jié)果:IGFBP7表達(dá)越高,病人的預(yù)后越好(p=0.012),且IGFBP7是個(gè)獨(dú)立評價(jià)預(yù)后因子,我們認(rèn)為:IGFBP7是結(jié)直腸癌的保護(hù)因子,扮演著腫瘤抑制基因的角色. 我們通過上述第一部

10、分的實(shí)驗(yàn)明確了IGFBP7在結(jié)直腸癌中的抑癌的生物學(xué)功能.前期在進(jìn)行IGFBP7在結(jié)直腸癌組織的研究時(shí),我們意外地發(fā)現(xiàn)其表達(dá)水平與病人空腹血糖水平成正相關(guān),提示IGFBP7是個(gè)與2型糖尿病相關(guān)的分子.其它實(shí)驗(yàn)室的研究也提示IGFBP7在前列腺癌、乳腺癌、肺癌中是個(gè)潛在的抑癌基因,同時(shí)近年來的研究也提示IGFBP7與胰島素抵抗、2型糖尿病相關(guān).迄今為止.IGFBP7在腫瘤和糖尿病的發(fā)生發(fā)展中具有重要生物學(xué)作用已經(jīng)明確,但I(xiàn)GFBP7的深入

11、分子機(jī)制一直未闡明.接下去我們的工作就是要探索IGFBP7上述生物學(xué)效應(yīng)的分子機(jī)制,更深入客觀地了解這個(gè)因子,為我們所觀察檢測到的IGFBP7相關(guān)生物學(xué)現(xiàn)象提供機(jī)制支持. 為了客觀深入地檢測IGFBP7引起的結(jié)直腸癌細(xì)胞的內(nèi)部變化,我們采用Affymetrix HGU133 plus 2.0全基因組芯片與雙向凝膠電泳(two dimensional electruphoresis,2-D)技術(shù)從轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平觀察轉(zhuǎn)染IGFB

12、P7到RKO細(xì)胞后(IGFBP7轉(zhuǎn)染株作為實(shí)驗(yàn)組,以空載體轉(zhuǎn)染株作為對照組)引起的效應(yīng)分子改變.為避免克隆間本身存在的差異,我們在每組中均挑取了三個(gè)克隆,組成三個(gè)配對組,每組用完全一樣的培養(yǎng)條件,以減少外界環(huán)境帶來的假陽性差異表達(dá)基因. Affymetrix芯片結(jié)果顯示,在三組中具有重復(fù)性交化趨勢的基因共有78個(gè),我們對這些基因進(jìn)行了Gone Ontology分析,發(fā)現(xiàn)了一系列非常有意思的現(xiàn)象.信號通路富集度分析顯示:MAPK(

13、Mitogen-Activated Protein Kinase)通路、胰島素/IGFl通路、TGF-β通路顯著富集,提示IGFBP7與相關(guān)通路關(guān)系密切.具體參與的基因是: MAPK通路:GADD45B,FOS,RASAI,FLNB,NR4AI.主要涉及到:ERKI/2,JNK和p38 MAP激酶通路. 胰島素/IGFI通路:IRSl,RASAl,FOS.其中RASAl與FOS屬M(fèi)APK通路部分. TGF.B通路

14、:CDKN2B,IDl,ID3,SMAD3. 用有向無環(huán)圖分析所篩基因的功能富集趨勢,結(jié)果顯示細(xì)胞骨架、actin相關(guān)基因顯著富集,提示通過對細(xì)胞骨架的重塑也許是IGFBP7發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)的重要機(jī)制之一.IGFBP7引起細(xì)胞骨架相關(guān)基因改變與我們觀察到的IGFBP7引起RKO細(xì)胞變狹長的形態(tài)改變相呼應(yīng),提示IGFBP7也許是通過對這些基因的影響進(jìn)而引起細(xì)胞形態(tài)的改變. 在三個(gè)克隆里具有一致性變化的基因有16個(gè):包括IG

15、FBP7,TAGLN,SPl40,FRMD4A,CALD,NAV3,SOX9-box 9STCl,AREG,ID1,IRS1,TACSTD,IERSL,CDKN2B,SYN1.這些基因已經(jīng)得到了熒光定量PCR的驗(yàn)證. 本文又在另外一株結(jié)腸癌細(xì)胞株SW620中進(jìn)行了這些基因的驗(yàn)證以明確IGFBP7引起的這些差異表達(dá)基因是否具有在結(jié)直腸癌細(xì)胞的廣譜效應(yīng).結(jié)果發(fā)現(xiàn).并不是所有驗(yàn)證的基因都具有一致的變化情況,提示著在不同細(xì)胞類型,IGF

16、BP7會引起不同的下游分子改變.但I(xiàn)GFBP7上調(diào)AREG,P15,ID1,IERSL,IRS1,SOX9,STC1,SYNI,下調(diào)TAGLN在RKO,SW620中均獲得驗(yàn)證,提示這些基因可能受IGFBP7的表達(dá)調(diào)控,有可能是IGFBP7的下游信號分子,對于我們將來深入的研究提供了重要的線索. 雙向凝膠電泳篩選差異表達(dá)蛋白顯示:IGFBP7下調(diào)ALB,HSP60.Actin cytoplasmic 1或2,PKM2,FARSB.

17、信息覆蓋量較少.唯有與芯片結(jié)果相互輝映的是:IGFBP7對actin有影響,進(jìn)一步支持提示IGFBP7可能是個(gè)細(xì)胞骨架相關(guān)基因. 通過我們以上關(guān)于IGFBP7在結(jié)直腸癌細(xì)胞的生物學(xué)功能研究以及效應(yīng)分子初步探索,我們得出以下結(jié)論: 1.IGFBP7對結(jié)直腸癌細(xì)胞具有抑制生長、降低軟瓊脂克隆形成能力、誘導(dǎo)凋亡的作用,在結(jié)直腸癌中扮演著抑癌角色. 2.IGFBP7可能是個(gè)細(xì)胞骨架相關(guān)基因,通過對細(xì)胞骨架的重塑也許是IG