AMHRⅡ、INSR基因DNA甲基化與PCOS表觀遺傳學(xué)研究.pdf

1、多囊卵巢綜合征（Polycystic ovary syndrome，PCOS）是指女性青春期發(fā)病，以月經(jīng)紊亂、持續(xù)排卵障礙和卵巢多囊樣改變，合并高雄激素血癥（Hyperandrogenism，HA）和高胰島素血癥(Hyperinsulinemia，HI)為主要臨床特征的生殖功能障礙與代謝異常并存的內(nèi)分泌紊亂綜合癥。PCOS臨床表現(xiàn)多樣化，表現(xiàn)為高度異質(zhì)性和家族聚集現(xiàn)象。目前有關(guān)PCOS病因和發(fā)病機(jī)理研究有諸多報(bào)道，但其病因和確切發(fā)病機(jī)制

2、仍不清楚。尤其是PCOS發(fā)病表現(xiàn)為家族聚集性，諸多學(xué)者認(rèn)為遺傳因素在PCOS病因?qū)W方面起重要作用。近年研究熱點(diǎn)關(guān)注表觀遺傳學(xué)領(lǐng)域，PCOS所致高雄激素血癥及胰島素血癥這兩大分泌特征以及其相關(guān)基因的研究引起學(xué)者更多的關(guān)注，從表觀遺傳學(xué)進(jìn)行研究報(bào)道較少。
　　抗苗勒管激素（Anti-müllerian hormone，AMH）是卵巢顆粒細(xì)胞分泌的一種局部調(diào)節(jié)因子，目前研究發(fā)現(xiàn)其與卵泡生長(zhǎng)發(fā)育有重要作用，AMH對(duì)PCOS局部病理變化的研

3、究主要集中在因卵巢局部調(diào)節(jié)因子的表達(dá)與調(diào)控異常而導(dǎo)致的一系列病理生理改變，而不同患者表現(xiàn)出較大差異。研究表明，AMH主要通過(guò)其相應(yīng)的受體（主要是其II型受體）發(fā)揮其相應(yīng)的生物學(xué)作用，表現(xiàn)出旁分泌局部調(diào)節(jié)參與系列的代謝途徑。抗苗勒管II型受體（Anti-müllerian hormone receptor II，AMHRII）在PCOS卵巢局部和子宮內(nèi)膜病理變化中作用的研究鮮有報(bào)道，其在PCOS發(fā)生過(guò)程中的分子遺傳作用機(jī)制尚無(wú)描述。高胰島

4、素血癥是PCOS的另一重要病理生理特征之一，主要表現(xiàn)為臨床上的胰島素抵抗（Insulin resistance，IR）近期的研究發(fā)現(xiàn)PCOS患者卵巢局部及子宮內(nèi)膜等均存在著胰島素抵抗的證據(jù)，胰島素受體（Insulin receptor，INSR）成為近年來(lái)研究胰島素抵抗的重要靶點(diǎn)。有關(guān)胰島素抵抗發(fā)生的機(jī)理多認(rèn)為與胰島素受體數(shù)目和功能相關(guān)，但實(shí)際上研究報(bào)道結(jié)論不一。隨著分子遺傳學(xué)的發(fā)展，尤其是表觀遺傳學(xué)這一領(lǐng)域的研究深入，諸多學(xué)者試圖通過(guò)

5、尋找與PCOS典型病理特征的相關(guān)基因，觀察相關(guān)基因是否存在表觀遺傳學(xué)的改變來(lái)解釋有關(guān)高度異質(zhì)性和家族聚集現(xiàn)象。DNA甲基化分析是常用的手段之一，從表觀遺傳學(xué)角度分析PCOS相關(guān)基因的DNA甲基化程度有望發(fā)現(xiàn)PCOS發(fā)病機(jī)制的可能原因，因而成為近年研究PCOS的熱點(diǎn)。
　　本研究主要通過(guò)收集PCOS患者的臨床信息資料，描述其臨床上的基本特征，并通過(guò)與正常人群的比較，研究和分析各種PCOS臨床特征與AMHRII、INSR受體在卵巢、子

6、宮內(nèi)膜局部的定位、分布及表達(dá)，以及通過(guò)對(duì)兩種受體基因DNA甲基化的關(guān)聯(lián)性，探討PCOS高度異質(zhì)性和家族聚集現(xiàn)象與表觀遺傳學(xué)關(guān)系，為進(jìn)一步闡明PCOS的發(fā)病機(jī)制提供新的思路。
　　目的
　　1．通過(guò)收集PCOS患者基本信息和臨床資料，描述和分析其臨床基本特征。
　　2．采用免疫組織化學(xué)方法，分析和比較AMHR II、INSR在PCOS患者卵巢和子宮內(nèi)膜的定位、分布及表達(dá)，描述AMHRII、INSR在卵巢、子宮內(nèi)膜病理變化

7、與臨床特征的關(guān)聯(lián)性。
　　3．通過(guò)重亞硫酸鹽處理測(cè)序法定量分析AMHR II、INSR基因DNA甲基化程度與臨床特征的關(guān)系，探討DNA甲基化與PCOS臨床特征、異質(zhì)性和家族聚集現(xiàn)象的關(guān)系，進(jìn)一步闡明PCOS與表觀遺傳學(xué)的關(guān)系。
　　方法
　　1．PCOS患者臨床資料收集和分析隨機(jī)收集2014年03月—2014年12月在廣東省計(jì)劃生育?？漆t(yī)院門診就診及住院的95患者為研究對(duì)象，完成問(wèn)卷填寫相關(guān)信息、B超檢查和其他臨床資料

8、。
　　2．血液生殖相關(guān)激素測(cè)定采集患者月經(jīng)周期第2-4天血液，采用ELISA法檢測(cè)血清雌二醇(E2)、孕激素（P）、睪酮(T)、黃體生成素(LH)、卵泡刺激素(FSH)水平，計(jì)算卵泡刺激素/黃體生成素(FSH/LH)比值?？崭挂葝u素（FINS）及空腹血糖（FPG）值，并計(jì)算HOMA-IR指數(shù)。
　　3．病理組織形態(tài)學(xué)分析及鑒定取卵巢、子宮內(nèi)膜組織后固定石蠟包埋，采用HE染色的方法進(jìn)行病理組織形態(tài)學(xué)觀察和分析。
　　4

9、．蛋白定位表達(dá)情況分析采用免疫組織化學(xué)（Immuno-Histochemistry，IHC）方法分別標(biāo)記AMHRII和INSR，觀察其在卵巢、子宮內(nèi)膜中的定位、分布。
　　5．受體基因甲基化的測(cè)定與分析采用重亞硫酸鹽處理測(cè)序法定量檢測(cè)兩組血液AMHRII、INSR基因DNA甲基化程度，軟件計(jì)算甲基化率。
　　6．統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS21軟件進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)，分析AMHR II、INSR基因DNA甲基化程度與臨床特征的關(guān)系，以及

10、闡明PCOS與表觀遺傳學(xué)作用機(jī)制。
　　結(jié)果
　　1．PCOS患者臨床資料基本特征收集的95例PCOS患者中，臨床特征表現(xiàn)多樣化，符合PCOS臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)；75例PCOS患者臨床特征中，表現(xiàn)月經(jīng)正常組18例，占24％；表現(xiàn)多囊卵巢改變54例，占72%；表現(xiàn)高雄激素或高雄激素體征共53例，占70.7%；表現(xiàn)胰島素抵抗48例，占64%。表現(xiàn)月經(jīng)正常組與稀發(fā)組兩組之間的比較，月經(jīng)稀發(fā)組年齡低，兩者比較有顯著性差異（P<0.05）。

11、表現(xiàn)IR組與無(wú)IR兩組之間，IR組表現(xiàn)月經(jīng)稀發(fā)現(xiàn)象，兩者比較有顯著性差異（（P<0.05）。
　　2．病理組織形態(tài)學(xué)HE分析 PCOS患者卵巢可見(jiàn)多個(gè)擴(kuò)張的囊泡，顆粒細(xì)胞層數(shù)減少，間質(zhì)增生，成熟黃體少見(jiàn)；正常組見(jiàn)不同發(fā)育階段的卵泡，顆粒細(xì)胞層較厚，可見(jiàn)成熟黃體。PCOS患者組子宮內(nèi)膜增厚，腺上皮細(xì)胞增生，腺體扭曲，間質(zhì)明顯增生；正常組子宮內(nèi)膜未見(jiàn)明顯增生。
　　3．免疫組織化學(xué)分析AMHRII、 INSR
　　AMHR

12、II、INSR在PCOS患者組及對(duì)照組的卵巢、子宮內(nèi)膜均有表達(dá)。AMHRII、的表達(dá)主要定位于細(xì)胞膜，INSR表達(dá)主要定位在細(xì)胞漿，PCOS患者組INSR在卵巢顆粒細(xì)胞、卵巢間質(zhì)細(xì)胞均有表達(dá)。AMHRII在顆粒細(xì)胞中表達(dá)更明顯，卵巢間質(zhì)中見(jiàn)少量分布。對(duì)照組AMHRII、 INSR主要在未成熟卵泡顆粒細(xì)胞表達(dá)，間質(zhì)中見(jiàn)少量分布。PCOS患者組見(jiàn)INSR強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，整體高于對(duì)照組。AMHRII在卵巢中的表達(dá)稍高于對(duì)照組，INSR在PCOS及

13、對(duì)照組卵巢中表達(dá)無(wú)明顯差異，AMHRII在PCOS及對(duì)照組子宮內(nèi)膜表達(dá)無(wú)明顯差異。
　　4．重亞硫酸鹽處理測(cè)序法定量分析DNA甲基化
　　4.1 AMHR2基因DNA甲基化60例樣本AMHR2基因DNA甲基化的共檢測(cè)四個(gè)位點(diǎn)，其中PCOS組40例，正常組20例，其中P1、P2兩組間無(wú)顯著差異；其中P3、P4兩組間有顯著差異。在40例PCOS組內(nèi)包括①月經(jīng)稀發(fā)②高雄激素血癥或高雄激素體征③一側(cè)或雙側(cè)卵巢多囊樣變?nèi)?xiàng)臨床表現(xiàn)，滿

14、足其中兩項(xiàng)或三項(xiàng)癥狀齊全，共分四組，它們組間無(wú)相關(guān)性（P>0.05）；PCOS組內(nèi)不同臨床特征進(jìn)行AMHRII基因甲基化程度與胰島素抵抗關(guān)系有顯著差異（R=0.532，p=0.00）。
　　4.2 INSR基因DNA甲基化60例樣本INSR基因DNA甲基化的共檢測(cè)四個(gè)位點(diǎn)，其中PCOS組40例，正常組20例，其中P1、P2兩組間無(wú)顯著差異；其中P3、P4兩組間有顯著差異。在40例PCOS組內(nèi)包括①月經(jīng)稀發(fā)②高雄激素血癥或高雄激素體

15、征③一側(cè)或雙側(cè)卵巢多囊樣變?nèi)?xiàng)臨床表現(xiàn)，滿足其中兩項(xiàng)或三項(xiàng)癥狀齊全，共分四組，它們組間不同臨床特征組間無(wú)相關(guān)性（P>0.05）；PCOS組內(nèi)不同臨床特征進(jìn)行INSR基因甲基化程度與胰島素抵抗關(guān)系有顯著差異（R=0.281，p=0.03）。
　　結(jié)論
　　1．AMHRII、INSR基因DNA甲基化與PCOS臨床基本特征有相關(guān)性，與PCOS不同臨床特征組間無(wú)相關(guān)性；AMHRII、INSR基因DNA甲基化與胰島素抵抗有關(guān)聯(lián)性。

16、r>　　2．INSR受體在PCOS患者子宮內(nèi)膜中表達(dá)強(qiáng)陽(yáng)性，而AMHRII受體表達(dá)稍高，表明AMHRII也參與子宮內(nèi)膜病變，INSR高表達(dá)可能與子宮內(nèi)膜增生有相關(guān)性。
　　3．PCOS患者卵巢中INSR在卵泡及間質(zhì)表達(dá)無(wú)明顯改變，但在間質(zhì)血管上皮表達(dá)明顯，推測(cè)可能與卵巢間質(zhì)增生有相關(guān)性。
　　4．PCOS患者臨床特征多樣化，符合PCOS臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，表現(xiàn)異質(zhì)性；月經(jīng)稀發(fā)與年齡低呈相關(guān)性，年齡低者月經(jīng)稀發(fā)率高；有IR者多伴有表