高原適應(yīng)表觀遺傳學(xué)甲基化研究技術(shù)MS-RDA的優(yōu)化與應(yīng)用.pdf

1、背景:內(nèi)地人進(jìn)入高原往往會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的高原反應(yīng)。而在那里世代居住的少數(shù)民族已經(jīng)由長(zhǎng)期自然選擇適應(yīng)了高原環(huán)境，這種適應(yīng)能力是可以遺傳的。目前關(guān)于高原適應(yīng)的研究多集中在以序列改變?yōu)榛A(chǔ)的基因多態(tài)性引起的多等位基因方面，無(wú)論是習(xí)服理論還是需要長(zhǎng)期自然選擇的基因多態(tài)性理論都不能解釋這些在胚胎期和嬰幼兒期出現(xiàn)的高原適應(yīng)性改變，近年來(lái)表觀遺傳學(xué)的新理論、新方法的出現(xiàn)為解釋發(fā)育性適應(yīng)提供了可能，基因的表觀遺傳學(xué)改變也可遺傳，且已被證明同樣是基因調(diào)節(jié)的重

2、要方式。但胚胎期或者發(fā)育期高原低氧是否能夠引起表觀遺傳的改變，導(dǎo)致機(jī)體對(duì)高原的長(zhǎng)期適應(yīng)目前國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。有研究發(fā)現(xiàn)缺失DNA甲基化酶的一種結(jié)核桿菌比其他組死亡速度加快，即DNA甲基化酶在低氧適應(yīng)過(guò)程中可能起到重要的作用，而DNA甲基化在高原適應(yīng)的表觀遺傳學(xué)研究中的意義尚未見(jiàn)報(bào)道，我們決定從甲基化差異入手探尋高原適應(yīng)在基因水平上新的機(jī)制，這在高原適應(yīng)的表觀遺傳學(xué)研究中尚屬首次。
　　方法:1.MS-RDA法優(yōu)化:甲基化敏感的代

3、表性差式分析(Methylation-SensitiveRepresentational Difference Analysis，MS-RDA)是通過(guò)基因組消減雜交方法來(lái)篩選不同來(lái)源的兩個(gè)基因組中差異甲基化片段的重要方法，經(jīng)典MS-RDA法經(jīng)過(guò)酶切和回收后需要更換好幾次DNA接頭，且步驟繁瑣，這樣降低實(shí)驗(yàn)的效率因而需要的樣本量比較大（每次實(shí)驗(yàn)需10μg）。為此，我們根據(jù)一種先分別運(yùn)用含dUTP的dNTP以及含dTTP的dNTP混合物進(jìn)行

4、PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增子雜交后再使用UDG酶和S1核酸酶切割雙鏈驅(qū)趕子DNA以及驅(qū)趕子和檢測(cè)子DNA雜交體的方法對(duì)傳統(tǒng)的MS-RDA進(jìn)行了改良，大大簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)程序，降低了樣本需求量并提高了獲得差異甲基化DNA片段的機(jī)率。在進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)之前，首先驗(yàn)證了改良的MS-RDA方法的特異性，將完全相同的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞基因組DNA分別作為檢測(cè)子和驅(qū)趕子進(jìn)行實(shí)驗(yàn)排除出現(xiàn)假陽(yáng)性的可能;為判斷改良方法的靈敏性，在兩份相同的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的基因組DNA樣品中分

5、別加入線性化的未用HpaⅡ甲基化酶處理（作為檢測(cè)子DNA）以及經(jīng)HpaⅡ甲基化酶處理的pUC19質(zhì)粒（作為驅(qū)趕子DNA），隨后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)并將得到的差異片段連接至pcDNA3-T載體，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，挑取陽(yáng)性克隆，進(jìn)行序列分析。
　　2.分子克隆方法優(yōu)化:將5'和3'端含有XcmⅠ識(shí)別序列的人組蛋白H4 cDNA定向克隆至pCDNA3.0表達(dá)載體中，在用XcmⅠ酶切得到基于pCDNA3.0載體骨架的T載

6、體，為檢測(cè)T載體的可用性，分別將長(zhǎng)度為312bp和1329bp的cDNA片段與其連接并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子，通過(guò)菌液PCR和瓊脂糖凝膠電泳估算轉(zhuǎn)化子的陽(yáng)性率。
　　3.世居高原人群特征性基因甲基化片段篩選:在證實(shí)了改良的MS-RDA方法的特異性和靈敏性之后，我們分別提取了五個(gè)世居高原的柯?tīng)柨俗巫迦搜旱幕蚪MDNA以及五個(gè)平原的柯?tīng)柨俗巫迦搜旱幕蚪MDNA，以高原柯族人的血液基因組DNA作為驅(qū)趕子

7、(Driver)，以平原柯族人的血液基因組DNA作為檢測(cè)子(Tester)，用改進(jìn)后的MS-RDA法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將得到差異片段切膠回收后按照優(yōu)化過(guò)的連接方案連接我們自己構(gòu)建的pcDNA3-T載體并轉(zhuǎn)化測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST分析及人類(lèi)基因組定位分析。
　　結(jié)果:1.改良MS-RDA方法:對(duì)改良的MS-RDA方法特異性分析表明，兩組相同DNA進(jìn)行酶切、擴(kuò)增、雜交、消化、擴(kuò)增等步驟后沒(méi)有得到差異化條帶，表明本方法具有很好的特異性;

8、在相同的基因組中分別加入甲基化差異的DNA再運(yùn)用改良的MS-RDA方法實(shí)驗(yàn)，結(jié)果得到了特異的差異條帶，對(duì)條帶進(jìn)行序列分析，結(jié)果完全符合預(yù)期，說(shuō)明經(jīng)改良后的MS-RDA方法具有很好的靈敏性。
　　2.基于XcmⅠ識(shí)別序列的T載體的構(gòu)建及其與PCR片段連接的條件優(yōu)化經(jīng)XcmⅠ酶切后的T載體能高效地與目的DNA片段連接;除T載體本身質(zhì)量外，擴(kuò)增DNA片段所用引物的磷酸化與否也是影響克隆效率的重要因素之一;對(duì)較大的插入片段而言，經(jīng)PCR擴(kuò)

9、增、純化后再用Taq DNA聚合酶和dATP處理也能夠顯著增加連接效率。
　　3.運(yùn)用改良的MS-RDA法對(duì)五對(duì)高原和平原的柯?tīng)柨俗巫逖夯蚪MDNA樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，共獲得差異片段11條，其中5條編碼序列被GENBANK收錄，均位于線粒體上，片段兩端位點(diǎn)確實(shí)具有HpaⅡ酶切位點(diǎn)，其中2條為編碼COX1片段，3條為編碼NADH還原酶2、4和5的序列。
　　結(jié)論:建立了改良的MS-RDA方法，該方法具有很好的特異性和靈敏性，該方法

10、是篩選差異甲基化基因的一種比較好的方法;基于XcmⅠ識(shí)別序列的T載體的構(gòu)建及其與PCR片段連接的條件優(yōu)化克服了對(duì)藍(lán)白篩選或插入自殺基因等條件的限制，可為常規(guī)的實(shí)驗(yàn)室容易的制備T載體并進(jìn)行高效地連接提供了高效的途徑;運(yùn)用改良的MS-RDA方法發(fā)現(xiàn)了在世居高原和平原柯?tīng)柨俗巫迦巳貉夯蛑屑谆讲町惖腄NA片段。對(duì)得到的11條差異的DNA片段進(jìn)行克隆、序列分析并BLAST分析后發(fā)現(xiàn)有五條被GenBank收錄的差異片段，其中兩條為在線粒體