惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的建立及其腫瘤干細(xì)胞生物學(xué)特性的初步研究.pdf

1、腦腫瘤是成人危害性極大的惡性腫瘤之一，兒童因腫瘤而死亡的主要腫瘤類型，發(fā)病率和死亡率不斷升高，嚴(yán)重的威脅著人類的健康和生命。在過去25年里，原發(fā)惡性腦腫瘤病人一直在增加，尤其在中年人以每年1.2％的速率在增加。2006年，在美國(guó)約有18120個(gè)新發(fā)腦腫瘤病人，其中約12820個(gè)死亡。多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)，顱內(nèi)腫瘤分類屬星形細(xì)胞瘤Ⅲ-Ⅳ級(jí)，是最常見的顱內(nèi)原發(fā)腫瘤之一，約占成人因腫瘤而死亡總?cè)藬?shù)的2.3％。多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤病人占所

2、有膠質(zhì)瘤病人的一半以上，在北美每年約有8000到10000的新發(fā)病例，發(fā)病高峰多在45歲至55歲之間。近十年來(lái)，雖然對(duì)該腫瘤的病理生理特性有了進(jìn)一步的理解，但是其治療沒有任何進(jìn)展。經(jīng)外科手術(shù)、甚至聯(lián)合放療與化療，患者愈后仍很差，其中位生存期無(wú)明顯改善，一般在9-12個(gè)月之間，且病人幾乎無(wú)一例外的會(huì)出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)。 最近研究發(fā)現(xiàn)，腦腫瘤中存在著具有干細(xì)胞自我更新特性的細(xì)胞亞群即腦腫瘤干細(xì)胞(BTSC)，是引發(fā)腫瘤并維持腦腫瘤生長(zhǎng)的細(xì)

3、胞來(lái)源(TIC)，腫瘤干細(xì)胞可耐化療、耐放射，在腫瘤的復(fù)發(fā)過程中起著決定性的作用。BTSC是一群具有自我更新和重建原腫瘤組織表現(xiàn)型的腫瘤細(xì)胞，它具有三大特點(diǎn)即：無(wú)限增殖、自我更新、多潛能分化。在腫瘤球培養(yǎng)基(TSM)培養(yǎng)條件下，可以形成典型的神經(jīng)球樣結(jié)構(gòu)，并可表達(dá)一系列神經(jīng)干細(xì)胞(NSC)特異性標(biāo)記，如CD133、musashi、Nestin、bmi-1、PSP、melk等。在誘導(dǎo)分化條件下，可以分化表達(dá)神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞，

4、其表現(xiàn)型與來(lái)源腫瘤樣本相同。因此建立體外培養(yǎng)的惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系及分離培養(yǎng)腫瘤干細(xì)胞為進(jìn)一步研究腦腫瘤的發(fā)病機(jī)制和細(xì)胞生物學(xué)特性，為探索新型藥物治療該腫瘤提供了一個(gè)較理想的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?目的： 1．建立GBM細(xì)胞系，初步探討其生物學(xué)特性； 2．分離、培養(yǎng)及鑒定GBM腫瘤干細(xì)胞，初步探討生物學(xué)特性。 方法： 1．GBM原代細(xì)胞生長(zhǎng)的體外培養(yǎng)條件優(yōu)化 進(jìn)行GBM原代細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，分別采用不同的細(xì)胞分

5、離、純化方法和培養(yǎng)條件，優(yōu)化最適合GBM的培養(yǎng)條件。分離方法優(yōu)化：分別采用機(jī)械分離法、胰酶消化法；純化方法優(yōu)化：差異貼壁法、膠原酶消化法：培養(yǎng)條件優(yōu)化：培養(yǎng)基分別使用DMEM、RPMll640、DMEM/F12。 2．建系細(xì)胞株生物學(xué)特性初步研究 (1)體外實(shí)驗(yàn)研究：光鏡、電鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)、MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線及藥物敏感性、克隆形成實(shí)驗(yàn)了解細(xì)胞增殖特性、染色體核型分析探討細(xì)胞遺傳學(xué)特性。 (2)體

6、內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究：裸鼠原位接種檢測(cè)該細(xì)胞株的致瘤性，組織化學(xué)染色觀察其病理學(xué)特性。 3．GBM腫瘤干細(xì)胞分離、培養(yǎng)與鑒定 通過條件培養(yǎng)基分離、培養(yǎng)GBM干細(xì)胞；細(xì)胞計(jì)數(shù)法、有限稀釋實(shí)驗(yàn)及流式細(xì)胞儀對(duì)腫瘤干細(xì)胞進(jìn)行鑒定：原位接種腫瘤干細(xì)胞于裸鼠檢測(cè)該細(xì)胞的致瘤性，組織化學(xué)染色觀察其病理學(xué)特性，進(jìn)行體內(nèi)鑒定。 4.GBM腫瘤干細(xì)胞生物學(xué)特性的初步探討 通過RT-PCR比較單層貼壁生長(zhǎng)腫瘤細(xì)胞與腫瘤干細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)

7、的差異。通過流式細(xì)胞儀(FCM)比較單層貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞與腫瘤干細(xì)胞細(xì)胞周期、細(xì)胞亞群(SP)細(xì)胞比例及CDl33陽(yáng)性細(xì)胞含量的差異。 結(jié)論： 1.成功的建立了GBM原代細(xì)胞系，優(yōu)化了GBM原代培養(yǎng)條件。 2.該細(xì)胞系倍增時(shí)間60h，克隆形成率為4.04％，以非整倍體核型為主，可異種移植成瘤，鼠瘤組織表達(dá)GFAP、Nestin蛋白，提示建系成功?？蔀檫M(jìn)一步研究GBM的發(fā)病機(jī)制和細(xì)胞分子生物學(xué)特性提供較理想的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)

8、模型。 3.順鉑、鬼臼乙甙、丹參酮ⅡA對(duì)該GBM細(xì)胞系均有顯著的細(xì)胞毒作用，并呈劑量和時(shí)間效應(yīng)關(guān)系，為研發(fā)新型藥物治療該腫瘤提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 4.GBM腫瘤細(xì)胞中存在1.33％具有異常增殖能力的BTSC；可以利用條件培養(yǎng)基成功分離和培養(yǎng)BTSC；BTSC在TSM培養(yǎng)環(huán)境中可以增殖，形成連續(xù)傳代的腦腫瘤干細(xì)胞球。 5.BTSC表面標(biāo)志物的檢測(cè)：腫瘤球中40.2％的細(xì)胞為CDl33陽(yáng)性細(xì)胞，約9.1％的細(xì)胞為SP細(xì)胞

9、。 6.條件培養(yǎng)基培養(yǎng)后的GBM細(xì)胞僅1000即可在裸鼠原位成瘤：移植瘤與人體來(lái)源的原發(fā)腫瘤組織病理表現(xiàn)型一致，裸鼠移植瘤組織中表達(dá)CDl33、GFAP及Nestin蛋白，可以作為研究GBM的動(dòng)物模型。 7.GBM干細(xì)胞與單層貼壁細(xì)胞相比生物學(xué)特性有所改變。相關(guān)基因表達(dá)的改變：與單層貼壁生長(zhǎng)GBM細(xì)胞相比，BCRP-1、CD133、Nestin、Wnt mRNA表達(dá)較SSM培養(yǎng)細(xì)胞增強(qiáng)，GFAP、PTEN表達(dá)減弱；細(xì)胞周