人脈絡(luò)膜黑色素瘤腫瘤干細(xì)胞生物學(xué)特性研究.pdf

1、脈絡(luò)膜惡性黑色素瘤(choroidal melanoma，CM)是成年人最常見的眼內(nèi)原發(fā)惡性腫瘤之一。CM惡性程度高，可侵及單眼和雙眼，對視力損害極大，并可危及生命。脈絡(luò)膜黑色素瘤傳統(tǒng)治療方法是眼球摘除術(shù)，近年來，隨著早期準(zhǔn)確診斷和及時治療病例的增加以及新技術(shù)的應(yīng)用，在發(fā)達(dá)國家，眼球摘除術(shù)已經(jīng)較少應(yīng)用；更多地是根據(jù)腫瘤的大小、位置和范圍以及分類、分別提出了光凝治療、冷凍治療、鞏膜板放療、溫?zé)嶂委?、眼球摘除、眼?nèi)容剜除等相對適應(yīng)癥和綜合治

2、療等，大大提高了治療效果。而在我國，眼球摘除仍是主要的治療方法，為保住患眼，其他的治療方法已越來越多地被關(guān)注，但腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是其主要問題。因此對CM發(fā)病機(jī)制、早期診斷及治療的研究一直是腫瘤學(xué)家及眼科工作者要攻克的重點和難點，并具有非常重要的現(xiàn)實意義。 體外研究顯示，腫瘤內(nèi)的腫瘤干細(xì)胞具有維持腫瘤無限增殖以及藥物抗性的作用。因此腫瘤對化療藥物容易形成耐藥，直接影響治療效果。在我院的病例中，曾有使用深低溫冷凍治療視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤患

3、者，治療后視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤退變消失，患者的視力保持良好。在腫瘤治療領(lǐng)域中，深低溫冷凍治療也顯示了很好的治療前景。 為了驗證脈絡(luò)膜黑色素瘤中存在腫瘤干細(xì)胞，并明確深低溫冷凍對腫瘤干細(xì)胞的作用，及引起腫瘤細(xì)胞退變消失的機(jī)制，我們進(jìn)行了脈絡(luò)膜黑色素瘤中腫瘤干細(xì)胞(choroidal melanomastemcell,CMSC)的分離培養(yǎng)，研究其生物學(xué)特性。在分離純化成功后，進(jìn)一步研究深低溫凍融對腫瘤干細(xì)胞的殺傷作用，以及引起腫瘤細(xì)胞退變

4、的機(jī)制，為脈絡(luò)膜黑色素瘤的臨床治療提供新思路。 1.研究目的： 通過對OCM-1細(xì)胞中腫瘤干細(xì)胞的分離培養(yǎng)，驗證脈絡(luò)膜黑色素瘤中存在著腫瘤干細(xì)胞，進(jìn)一步純化腫瘤干細(xì)胞后，研究其生物學(xué)特性。利用深低溫反復(fù)凍融對腫瘤干細(xì)胞進(jìn)行殺傷，觀察殺傷作用，并分析殺傷的可能機(jī)制。 2.實驗方法： 使用無血清化學(xué)限定培養(yǎng)基(serum-free medium，SFM)，分離純化培養(yǎng)腫瘤干細(xì)胞，觀察細(xì)胞生長的變化。使用CD1

5、33，Musashi-1免疫細(xì)胞染色，誘導(dǎo)分化，動物實驗研究腫瘤干細(xì)胞的生物學(xué)特性。 深低溫反復(fù)凍融腫瘤細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞后，MTT法，克隆實驗檢測細(xì)胞抑制情況，HE染色，電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。 使用P16，Hoechst 33342免疫細(xì)胞化學(xué)染色，流式細(xì)胞儀檢測CD40及細(xì)胞膜電位的變化，并使用共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)鈣離子的變化。 3.結(jié)果： 3.1用SFM培養(yǎng)基培養(yǎng)后，細(xì)胞均為懸浮團(tuán)狀集落生長，呈現(xiàn)

6、典型的干細(xì)胞生長方式，CD133,Musashi-1陽性表達(dá)，并可以分化為HMB45，GFAP，S100，NSE陽性的細(xì)胞。1×105個CMSC細(xì)胞就可以在Balb/c裸小鼠體內(nèi)成瘤，而注射1×105個OCM-1細(xì)胞的Balb/c裸小鼠均未成瘤。 3.2凍融后OCM-1細(xì)胞出現(xiàn)大量的凋亡細(xì)胞，而CMSC則以壞死為主，凋亡細(xì)胞少見。電鏡下觀察到冰晶的結(jié)構(gòu)特征。 3.3激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，凍融次數(shù)的增加，OCM-1細(xì)胞

7、凋亡率增高。0.5×3組凋亡細(xì)胞最多，達(dá)到51％。流式細(xì)胞儀測定顯示凍融后細(xì)胞膜電位下降，凍融前后CD40陽性細(xì)胞比率差異明顯，且呈一定的量效關(guān)系。共聚焦顯微鏡觀察到凍融后細(xì)胞發(fā)生較高比例的凋亡，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度隨著細(xì)胞凋亡比率的增高而升高，Western blot檢測顯示細(xì)胞凍融后survivin蛋白表達(dá)增加。 4.結(jié)論： 4.1脈絡(luò)膜黑色素細(xì)胞中存在腫瘤干細(xì)胞，腫瘤干細(xì)胞具有分化和增殖的能力，且表現(xiàn)出更強(qiáng)的致瘤性。