脈絡膜黑色素瘤動物模型的建立及組織因子在腫瘤中的表達.pdf

1、背景：脈絡膜黑色素瘤(CM)是最常見的葡萄膜惡性腫瘤,其特點是惡性程度高,轉移早且廣泛,對患者的視力及生命造成嚴重威脅。在研究脈絡膜黑色素瘤時遇到的最主要的困難就是與其他腫瘤相比這種腫瘤的發(fā)生率很低,這樣要想獲得相當數(shù)量的標本就非常困難。在過去的數(shù)十年里,科學家研究脈絡膜黑色素瘤時所面對的主要挑戰(zhàn)是建立合適的動物模型。 目的：本研究采用人脈絡膜黑色素瘤細胞株OCM-1細胞作為研究對象,建立脈絡膜黑色素瘤兔模型,以期達到以下兩個實

2、驗目的：首先是利用該模型研究不同劑量的環(huán)孢素A對腫瘤生長、轉移的發(fā)生及對實驗動物生存時間的影響；其次利用免疫組織化學方法檢測組織因子在CM中的表達和定位,同時定量計數(shù)微血管密度(MVD),探討TF與MVD之間的相互關系。 方法：利用人脈絡膜黑色素瘤細胞株OCM-1細胞建立兔脈絡膜黑色素瘤動物模型。選取健康成年兔35只,雌雄不限。隨機分為A組(不注射環(huán)孢素A)、B組(注射環(huán)孢素A 15mg/kg/day)、C組(注射環(huán)孢素A 20

3、mg/kg/day)、D組(注射環(huán)孢素A 20mg/kg/day,2周后15mg/kg/day,4周后10mg/kg/day,6周后5mg/kg/day,維持),A組5只動物,B組、C組、D組分別10只動物。所有實驗動物左眼為手術眼。術后行B型超聲、MRI掃描、眼底照相,待其自然死亡后取下眼球、肺組織、肝組織作病理切片HE染色及免疫組織化學檢測。 結果： 1.生存時間:A組只有一只動物于4周時死亡,其余均于8周時處死。平

4、均生存時間為B組為5.74±0.64周,C組為4.33±0.41周,D組為5.71±0.81周。B組與C組之間的生存時間有顯著差異；C組與D組之間的生存時間有顯著差異；B組與D組之間的生存時間無明顯差異。Kaplan-Meier法累積生存率可以看出B組和D組有較好的生存率。 2.B型超聲：應用眼部B型超聲儀測量腫瘤最大基底直徑和高度,將兔眼內(nèi)的腫瘤假設成一個旋轉半橢圓體,采用旋轉橢圓體公式(4/3pa2H)的1/2計算。計算公式

5、為：2/3pa2H(其中H為腫瘤最大高度,a為腫瘤基底直徑的一半,π=3.14)。第一周時尚未能夠測量出腫瘤高度,僅見鞏膜壁局部增厚,自第二周開始記錄腫瘤基底直徑及高度。取同期的每組所有實驗動物眼內(nèi)腫瘤的平均體積繪制腫瘤生長曲線。前4周C組和D組實驗動物眼內(nèi)腫瘤生長速度相對較快,兩組無明顯差異。4周后C組實驗動物眼內(nèi)腫瘤平均體積繼續(xù)增大,增大速度加快。4周后D組實驗動物眼內(nèi)腫瘤平均體積增長速度減慢,5周后體積開始縮小,其中一只實驗動物眼

6、內(nèi)腫瘤于8周時已無法用B型超聲儀測量其大小,體積記為0。B組實驗動物眼內(nèi)腫瘤平均體積逐漸增大,生長速度較C組緩慢,但最終平均體積B組和C組無明顯差異。 3.HE染色：組織病理學檢測發(fā)現(xiàn)眼內(nèi)腫瘤發(fā)生率分別為B組60％(6只)、C組80％(8只)、D組40％(4只)。三組之間眼內(nèi)腫瘤陽性率無顯著差異。A組未發(fā)現(xiàn)腫瘤生長。各組眼內(nèi)病變均局限于脈絡膜,無一例出現(xiàn)虹膜及睫狀體轉移。肺部轉移病灶發(fā)現(xiàn)于B組2只(33.3％)、C組1只(12.

7、5％)、D組1只(25％)。三組之間肺部轉移發(fā)生率無顯著差異。三組均未發(fā)現(xiàn)肝臟轉移灶。 4.組織因子(TF)在腫瘤中的表達及與MVD的關系：眼內(nèi)腫瘤中TF染色陽性率為88.9％。B組、c組三組實驗動物的眼內(nèi)腫瘤的TF染色強度隨腫瘤體積的增大逐漸增加,中度陽性占多數(shù)。D組因腫瘤體積5周后逐漸下降,TF染色強度不隨時間延長而增加,染色強度以可疑陽性為主。發(fā)生肺轉移的實驗動物眼內(nèi)腫瘤的TF染色強度均明顯高于未發(fā)生肺轉移的實驗動物眼內(nèi)腫

8、瘤的強度。肺轉移灶瘤細胞的TF陽性率為100％。肺轉移瘤的TF染色強度均明顯高于眼內(nèi)原發(fā)腫瘤的TF表達強度。眼內(nèi)腫瘤TF表達強度與MVD數(shù)量呈正相關關系。轉移灶中的MVD數(shù)目較眼內(nèi)腫瘤中的MVD數(shù)目明顯增高。 結論：本課題通過采用人脈絡膜黑色素瘤細胞株OCM-1細胞,應用不同劑量環(huán)孢素A對兔進行免疫抑制,通過手術操作建立兔脈絡膜黑色素瘤動物模型并進行研究。得出以下結論： 1、成功建立兔脈絡膜黑色素瘤動物模型,此模型基本接

9、近人類疾病的特征,為下一步研究提供實驗基礎。 2、腫瘤的發(fā)生率及生長速度與環(huán)孢素A的劑量呈正相關,生存率與環(huán)孢素A的劑量呈負相關,轉移的發(fā)生與環(huán)孢素A的劑量無關。 3、眼科B型超聲儀檢測眼內(nèi)腫瘤簡單易行,應用于脈絡膜黑色素瘤動物模型建立過程中,能測算出腫瘤的體積,觀察不同劑量的環(huán)孢素A對腫瘤的生長速度的影響。 4、組織因子TF表達與MVD呈正相關關系,提示TF與脈絡膜黑色素瘤的發(fā)生、血管形成、轉移及預后有關,是反