仙臺(tái)病毒囊膜抗小鼠黑色素瘤的研究.pdf

1、小鼠惡性黑色素瘤(Malignant melanoma,MM)具有惡性程度高、易轉(zhuǎn)移和易復(fù)發(fā)等特點(diǎn),目前常規(guī)療法對(duì)其治療效果不是很好。研究表明,仙臺(tái)病毒囊膜(Hemagglutinating virus of Japan Envelope,HVJ-E)具備強(qiáng)大的抑制或消除腫瘤的功能,且在動(dòng)物腫瘤模型上得到了驗(yàn)證,但目前尚未有直接用HVJ-E治療小鼠黑色素瘤的研究報(bào)道。因此,我們開(kāi)展用HVJ-E治療小鼠黑色素瘤的研究,旨在初步探討其抗瘤機(jī)

2、制。
　　 首先,通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)觀察小鼠黑色素瘤細(xì)胞(B16F10)經(jīng)HVJ-E作用后的形態(tài)學(xué)變化,MTT、流式細(xì)胞檢測(cè)、免疫組化、免疫印跡法檢測(cè)經(jīng)HVJ-E作用后的B16F10細(xì)胞的增殖活性、凋亡水平及IGF1Rα、β-catenin表達(dá)情況。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)結(jié)果顯示,PBS陰性對(duì)照組細(xì)胞貼壁良好,呈梭形,生長(zhǎng)活躍,折光性好;而HVJ-E處理組細(xì)胞皺縮,破裂,呈不規(guī)則形態(tài),有的細(xì)胞兩端出現(xiàn)細(xì)長(zhǎng)的偽足,脫落細(xì)胞增多。MTT法

3、檢測(cè)結(jié)果顯示,不同濃度的HVJ-E對(duì)細(xì)胞都有明顯抑制作用并呈劑量-效應(yīng)關(guān)系,500 MOIHVJ-E組在處理72 h后與同時(shí)段對(duì)照組相比有顯著差異(p＜0.05);1000 MOIHVJ-E組在處理72 h后與同時(shí)段對(duì)照組相比差異極顯著(p＜0.01);隨著HVJ-E處理濃度的增大,B16F10細(xì)胞的凋亡率升高:HVJ-E組的IGF1Rα、β-catenin的表達(dá)明顯低于PBS對(duì)照組,且隨著HVJ-E處理濃度的增大,IGF1Rα、β-c

4、atenin蛋白表達(dá)量下降。該實(shí)驗(yàn)說(shuō)明HVJ-E具有直接促使小鼠黑色素瘤細(xì)胞凋亡的作用。
　　 其次,通過(guò)體外分離培養(yǎng)小鼠骨髓樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cell,DC),以500 MOIHVJ-E病毒樣粒子刺激小鼠骨髓DC,同時(shí)設(shè)PBS陰性對(duì)照與LPS陽(yáng)性對(duì)照,培養(yǎng)48 h后,檢測(cè)各組DC細(xì)胞上清中細(xì)胞因子的分泌水平和DC細(xì)胞表面分子的表達(dá)率。結(jié)果顯示,HVJ-E處理組DC細(xì)胞分泌的IFN-β、IFN-γ水平顯著高于PBS

5、、LPS對(duì)照組(p＜0.05),IL-6、TNF-α水平顯著高于PBS對(duì)照組(p＜0.05),但略低于LPS對(duì)照組;HVJ-E處理組的DC細(xì)胞表面分子CD80、CD40、CD11c和MHCⅡ均呈高表達(dá)。該實(shí)驗(yàn)說(shuō)明HVJ-E能夠刺激未成熟DC成熟并且分泌細(xì)胞因子從而發(fā)揮抗瘤作用。
　　 最后,通過(guò)C57BL/6J小鼠皮內(nèi)接種B16F10細(xì)胞制作小鼠黑色素瘤模型,待瘤體直徑達(dá)0.5 cm時(shí),將荷瘤小鼠隨機(jī)分組,每組20只,實(shí)驗(yàn)組小鼠

6、瘤內(nèi)注射HVJ-E病毒樣粒子,同時(shí)設(shè)PBS陰性對(duì)照組,4天之后重復(fù)治療,連續(xù)治療3次,每次治療后測(cè)量腫瘤體積,觀察并分析荷瘤鼠的存活率。另取兩組荷瘤小鼠,每組6只,瘤內(nèi)注射HVJ-E病毒樣粒子,同時(shí)設(shè)PBS陰性對(duì)照,連續(xù)注射3天,最后1次注射后24,48,120 h時(shí),每組各處死2只小鼠,分別取瘤組織進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)CD4,CD8,CXCL10,CD11c,IL-2,MITF,IGF1Rα,β-catenin mRNA的轉(zhuǎn)錄水平。

7、治療結(jié)果表明,HVJ-E治療組小鼠的腫瘤體積顯著小于PBS對(duì)照組,且在成瘤后40天內(nèi),HVJ-E治療組小鼠的存活率為80％,而對(duì)照組為0％。熒光定量PCR結(jié)果顯示HVJ-E治療組CD4,CD8,CXCL10,CD11c,IL-2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平在24,48,120 h時(shí)均高于PBS對(duì)照組,MITF,IGF1Rα,β-catenin mRNA轉(zhuǎn)錄水平在24,48 h時(shí)均低于PBS對(duì)照組。該實(shí)驗(yàn)說(shuō)明HVJ-E能激發(fā)機(jī)體的特異性與非特異性細(xì)

8、胞免疫,從而延長(zhǎng)黑色素瘤小鼠的生存期。
　　 體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明仙臺(tái)病毒囊膜(HVJ-E)能刺激DC成熟,釋放細(xì)胞因子,并具備潛在的免疫增強(qiáng)效應(yīng);HVJ-E能直接誘導(dǎo)小鼠黑色素瘤細(xì)胞凋亡,其作用機(jī)制可能與MITF,IGF1Rα和β-catenin的表達(dá)下降有關(guān);HVJ-E直接進(jìn)行瘤內(nèi)注射后能顯著抑制小鼠惡性黑色素瘤的生長(zhǎng),延長(zhǎng)荷瘤小鼠的生存期,其作用機(jī)制不僅僅體現(xiàn)在HVJ-E可誘導(dǎo)特異性細(xì)胞免疫的產(chǎn)生,還可能是HVJ-E的致腫瘤細(xì)胞