PI3K-Akt信號(hào)通路調(diào)控胞內(nèi)布魯氏菌16M存活的分子機(jī)制研究.pdf

1、布魯氏菌病(Brucellosis)是由布魯氏菌引發(fā)的一種人畜共患傳染病。布魯氏菌能夠抑制細(xì)胞的凋亡和促進(jìn)細(xì)胞的自噬，導(dǎo)致布魯氏菌在吞噬細(xì)胞中生存繁殖，它能引起人、畜多器官損傷和慢性感染，給人類健康和畜牧業(yè)和諧發(fā)展帶來(lái)嚴(yán)重威脅。已有研究表明PI3K/Akt信號(hào)通路不僅參與細(xì)胞凋亡、自噬等多種細(xì)胞活動(dòng)和生物學(xué)效應(yīng)還與病原體在細(xì)胞內(nèi)的生存繁殖密切相關(guān)，然而，該信號(hào)通路否參與了布魯氏菌在宿主細(xì)胞內(nèi)的生存繁殖尚鮮有報(bào)道，本研究通過(guò)探討PI3K/

2、Akt信號(hào)通路對(duì)胞內(nèi)布魯氏菌生存繁殖的影響及與布魯氏菌介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡、自噬的影響，揭示布魯氏菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)持續(xù)性感染的分子機(jī)制，為布魯氏菌病新藥物研發(fā)、防治及家畜抗病育種工作奠定基礎(chǔ)。
　　目的：⑴檢測(cè)布魯氏菌及脂多糖是否激活小鼠巨噬細(xì)胞的PI3K/Akt信號(hào)通路。⑵阻斷PI3K/Akt信號(hào)通路后檢測(cè)對(duì)羊種布魯氏菌16M生存繁殖在宿主體內(nèi)外的影響。⑶阻斷PI3K/Akt信號(hào)通路后檢測(cè)對(duì)羊種布魯氏菌16M介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響。⑷阻斷

3、PI3K/Akt信號(hào)通路后檢測(cè)對(duì)羊種布魯氏菌16M介導(dǎo)的細(xì)胞自噬的影響。（5）檢測(cè)PI3K催化亞基p110α在羊種布魯氏菌16M侵染巨噬細(xì)胞過(guò)程中的功能。從而揭示布魯氏菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)持續(xù)性感染的分子機(jī)制，為布魯氏菌病新藥物研發(fā)、防治及家畜抗病育種工作奠定基礎(chǔ)。
　　方法：①應(yīng)用Western blot技術(shù)檢測(cè)：布魯氏菌16M（16M）、其它菌株和脂多糖LPS對(duì)巨噬細(xì)胞內(nèi)p-Akt(S473)和p-Akt(T308)表達(dá)的影響；以及

4、16M對(duì)巨噬細(xì)胞內(nèi)p-Akt(S473)和p-Akt(T308)表達(dá)的影響是否與侵染時(shí)間和侵染比例有關(guān)；PI3K抑制劑2-(4-嗎琳基)-8-苯基-4氫-1-苯并毗喃-4酮（LY）對(duì)16M介導(dǎo)p-Akt(S473)和p-Akt(T308)表達(dá)的抑制效果。②抑制劑LY（LY）與巨噬細(xì)胞孵育1h，然后，用16M侵染巨噬細(xì)胞，未經(jīng)抑制劑LY處理的細(xì)胞作為對(duì)照組，分別在30min、45min、4h、12h和24h檢測(cè)布魯氏菌的CFU；用ELIS

5、A檢測(cè)細(xì)胞上清液中IFN-γ、IL-12p70和TNF-α的分泌。選取6-8周齡雌性BALB/c小白鼠（每組10只），腹腔注射抑制劑LY（20mg/kg/day）并持續(xù)到實(shí)驗(yàn)結(jié)束，給藥5天后感染16M，劑量為L(zhǎng)D100(4.6×108CFU/0.2mL)和LD50(6.3×107CFU/0.2mL)，統(tǒng)計(jì)小鼠的死亡率；感染1×106CFU/0.2mL劑量的16M，取小鼠脾臟和肝臟，計(jì)算16M的含量；利用病理切片技術(shù)，觀察病理變化。③抑制

6、劑LY與巨噬細(xì)胞作用1h，然后，用16M侵染巨噬細(xì)胞，未經(jīng)抑制劑LY處理的細(xì)胞作為對(duì)照組，利用caspase-3、8、9活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)其活性變化；利用實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)；利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡的變化。④用慢病毒包裝Plex-MSC-EGFP-LC3質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞，抑制劑LY與轉(zhuǎn)染的巨噬細(xì)胞作用1h，然后用16M感染細(xì)胞，在12h和24h，用共聚焦顯微鏡檢查EGFP-LC3綠色聚點(diǎn)，

7、及溶酶體與EGFP-LC3綠色聚點(diǎn)的共定位；利用投射電鏡觀察細(xì)胞中包含16M的自噬泡的數(shù)量。⑤對(duì)p110α基因設(shè)計(jì)四條特異性陽(yáng)性siRNA分子和一條陰性siRNA分子，構(gòu)建shRNA慢病毒表達(dá)載體pLentiLox-siRNA，將其轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞，通過(guò)熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)篩選出干擾效果最好的pLentiLox-siRNA質(zhì)粒；將最優(yōu)pLentiLox-siRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染RAW264.7巨噬細(xì)胞。
　　結(jié)果：⑴布魯氏菌16M感染細(xì)胞

8、后，p-Akt(S473)和p-Akt(T308)在第1h表達(dá)量最高，且顯著高于對(duì)照組和其他組（P<0.05），在第8h、12h和24h其水平恢復(fù)正常，與對(duì)照組相比其表達(dá)量無(wú)顯著差異（ P>0.05）。粗糙型的RB51、M5Δpgm感染的細(xì)胞中p-Akt(S473)和p-Akt(T308)表達(dá)顯著低于光滑型的M5、16M和S2308（P<0.01）。抑制劑LY對(duì)16M介導(dǎo)的p-Akt(S473)和p-Akt(T308)表達(dá)的阻斷具有濃度

9、依賴性。⑵在30min、45min、4h、12h和24h，LY處理組細(xì)胞中的細(xì)菌數(shù)量顯著低于對(duì)照組細(xì)胞(P<0.05)。在第10天，攻LD100和LD50劑量后16M+LY組的小鼠成活率分別為30％和60%，對(duì)照16M組小鼠成活率分別為0和30%；16M+LY組的小鼠血清中的IFN-γ、IL-12p70和TNF-α顯著高于16M組（P<0.01）；16M+LY組小鼠中CD8+T細(xì)胞百分比顯著高于16M組（P<0.05）；16M+LY組小

10、鼠的脾臟和肝臟的病理變化都比對(duì)照16M組小鼠較輕。⑶在4h、12h和24h，16M+LY組細(xì)胞caspase-3的OD405都顯著高于對(duì)照組細(xì)胞（P<0.05）；caspase-9的OD405值與caspase-3趨勢(shì)一致；16M+LY組細(xì)胞中Bax的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于16M組細(xì)胞(P<0.01），Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著低于16M組細(xì)胞（P<0.01），16M+LY組細(xì)胞中的cleaved PARP、Bax和Cyto

11、solic Cyt-c的蛋白表達(dá)量顯著高于16M組（P<0.01）；16M+LY組細(xì)胞凋亡率顯著高于16M組細(xì)胞（P<0.01）。⑷在12h和24h，16M+LY組的綠色熒光顆粒顯著低于16M組細(xì)胞（P<0.01）；16M+LY組細(xì)胞中Beclin1和ULK1 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著低于16M組細(xì)胞（P<0.01）；16M+LY組細(xì)胞中的LC3-II/LC3-I轉(zhuǎn)換率、Beclin1和ULK1的蛋白水平顯著低于16M組細(xì)胞（P<0.01

12、）；16M+LY組細(xì)胞中包含16M的自噬泡與16M組細(xì)胞相比明顯減少（P<0.01）。⑸在30min、45min和4h，p110α基因沉默組與正常細(xì)胞組內(nèi)16M的CFU無(wú)顯著差異（P>0.05），但在12h和24h時(shí)差異顯著（P<0.05）；在12h和24h，沉默p110α基因后，與對(duì)照組相比，感染細(xì)胞的caspase-3活性顯著提高(P<0.01）；促凋亡相關(guān)蛋白cleavedPARP、Bax和Cytosolic Cyt-c細(xì)胞凋亡率

13、也顯著提高（P<0.01）；16M介導(dǎo)的IL-12p70和TNF-α的水平顯著提高（P<0.01）。
　　結(jié)論：①布魯氏菌及其LPS可激活PI3K/Akt信號(hào)通路。②抑制劑LY可顯著降低16M在宿主體內(nèi)和體外的存活，可提高宿主的細(xì)胞免疫抵抗16M感染。③抑制劑LY可顯著提高16M介導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞凋亡，并且這種細(xì)胞凋亡依賴caspase-3和caspase-9的活性。④抑制劑LY可顯著抑制16M介導(dǎo)的RAW264.7巨