肝激酶B1在肝門(mén)部膽管癌中的表達(dá)及其對(duì)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響.pdf

1、第一部分LKB1在肝門(mén)部膽管癌中的表達(dá)及其與臨床預(yù)后關(guān)系的分析
　　 研究背景和目的:
　　 肝門(mén)部膽管癌(Hilar Cholangiocarcinoma,HC)是膽道最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,占膽道腫瘤的60％。近年來(lái)發(fā)病率逐年上升。臨床上,手術(shù)切除仍然是HC的首選治療手段。但手術(shù)要求高,難度大,導(dǎo)致了只有小部分患者獲得手術(shù)切除的機(jī)會(huì)。即使能獲得根治性手術(shù),其術(shù)后早期復(fù)發(fā),肝內(nèi),淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移仍然是影響患者生存的主要因

2、素。所以尋找可行有效的非手術(shù)干預(yù)治療手段是改善HC患者生存的唯一途徑。研究表明,肝激酶B1(Liver kinase B1,LKB1)基因的缺失能夠顯著的促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移。多項(xiàng)研究表明,人體多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)LKB1的缺失對(duì)疾病的進(jìn)展速度和患者的預(yù)后有著明顯的影響,這可能是LKB1缺失激活了下游的某些信號(hào)通路促進(jìn)了腫瘤的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移。但是,目前對(duì)于LKB1缺失促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的分子機(jī)制,還有很多問(wèn)題亟待研究澄清,如LKB1在腫瘤中的缺失是以何

3、種機(jī)制為主,以基因的丟失,基因的甲基化,基因的突變？LKB1缺失以后是如何激活下游信號(hào)通路,進(jìn)而影響腫瘤的生物學(xué)行為？深入研究LKB1調(diào)控癌細(xì)胞生長(zhǎng)的分子機(jī)制,有可能為肝門(mén)部膽管癌等惡性腫瘤提供有效的治療靶點(diǎn)。在本研究的第一部分,我們擬首先選取合適的肝門(mén)部膽管癌組織樣本制作組織芯片,利用組織芯片檢測(cè)LKB1在腫瘤組織中的表達(dá)情況。
　　 研究方法:
　　 在得到患者知情同意之后,收集手術(shù)切除的新鮮標(biāo)本,同意病人標(biāo)本一部分

4、用福爾馬林固定,包埋蠟塊用來(lái)制作組織芯片;針對(duì)符合入組標(biāo)準(zhǔn)的患者,明確病例診斷后,完善患者臨床病例資料,密切定期隨訪,建立完整的臨床數(shù)據(jù)資料庫(kù)。
　　 利用組織芯片,用免疫組化方法檢測(cè)LKB1蛋白在肝門(mén)部膽管癌組織中的表達(dá),制定染色評(píng)分標(biāo)準(zhǔn),對(duì)LKB1表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)行量化評(píng)估。
　　 運(yùn)用JMP9,用Kaplan Meier生存分析和COX風(fēng)險(xiǎn)比例模型來(lái)分析LKB1與患者總體預(yù)后的關(guān)系,明確LKB1在肝門(mén)部膽管癌進(jìn)展中的作用

5、。
　　 結(jié)果:
　　 1、在327例肝門(mén)部膽管癌組織芯片中,260例(80％)癌組織中檢測(cè)到LKB1的表達(dá)呈不同程度的降低;LKB1在癌組織中的表達(dá)與患者的年齡相關(guān),年齡越大,LKB1降低的比率越高(P＜0.05),還與分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期相關(guān);2、單因素及多因素生存分析提示LKB1的低表達(dá)與肝門(mén)部膽管癌患者的差預(yù)后相關(guān),是肝門(mén)部膽管癌的獨(dú)立預(yù)后因素之一;
　　 結(jié)論:
　　 1、LKB1在

6、80％肝門(mén)部膽管癌組織中表達(dá)不同程度降低;2、LKB1的表達(dá)水平與肝門(mén)部膽管癌患者預(yù)后呈顯著負(fù)相關(guān),LKB1有可能成為反映肝門(mén)部膽管癌預(yù)后的一個(gè)重要指標(biāo)。
　　 第二部分LKB1表達(dá)缺失的機(jī)制及對(duì)細(xì)胞生物學(xué)行為的影響
　　 背景與目的:
　　 Lkb1在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用已經(jīng)逐漸被揭示。在前期探索LKB1調(diào)節(jié)功能的研究中,發(fā)現(xiàn)LKB1主要通過(guò)LKB1/AMPK/mTOR通路來(lái)發(fā)揮其腫瘤抑制基因的功能。在第一部分

7、中,我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)LKB1在肝門(mén)部膽管癌中的表達(dá)在80％的組織中呈不同程度的減低。而且預(yù)后分析發(fā)現(xiàn)LKB1的低表達(dá)與患者的總體生存時(shí)間呈顯著相關(guān)性。但是,LKB1在肝門(mén)部膽管癌組織中表達(dá)降低的機(jī)制還不明確。揭示LKB1表達(dá)缺失的機(jī)制,明確LKB1基因缺失對(duì)肝門(mén)部膽管癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響及其機(jī)制,并研究LKB1/AMPK通路在肝門(mén)部膽管癌靶向治療中的應(yīng)用。
　　 方法:
　　 1.利用組織芯片,采用熒光原位雜交(FISH)

8、技術(shù)檢測(cè)LKB1等位基因的丟失。設(shè)計(jì)雙色熒光探針,紅色熒光代表LKB1基因,綠色熒光代表染色體的中心粒。正常情況下應(yīng)該觀察到兩個(gè)紅色和兩個(gè)綠色探針。如果只觀察到一個(gè)紅色探針,說(shuō)明LKB1為雜合性丟失,如果沒(méi)有紅色探針,說(shuō)明LKB1為純合性丟失。
　　 2.運(yùn)用JMP9,用Kaplan Meier生存分析和COX風(fēng)險(xiǎn)比例模型來(lái)分析LKB1的丟失與患者總體預(yù)后的關(guān)系,明確LKB1在肝門(mén)部膽管癌進(jìn)展中的作用。
　　 3.體外觀

9、察LKB1對(duì)膽管癌細(xì)胞系生物學(xué)行為的影響:用LKB1 siRNA和ControlsiRNA分別轉(zhuǎn)染LKB1完整的膽管癌細(xì)胞系,用MTT,劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)來(lái)觀察沉默LKB1對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖,遷移和侵襲能力的影響。
　　 4.體外觀察LKB1對(duì)膽管癌細(xì)胞藥物敏感性的影響:用LKB1 siRNA和ControlsiRNA分別轉(zhuǎn)染LKB1完整的膽管癌細(xì)胞系,觀察二甲雙胍(Matformin)和苯乙雙胍(Phenformin

10、)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的情況。
　　 結(jié)果:
　　 1、FISH檢測(cè)發(fā)現(xiàn)近38％的肝門(mén)部膽管癌組織中LKB1呈不同形式的等位基因的缺失;
　　 2、沉默LKB1以后,膽管癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力明顯增強(qiáng);
　　 3、沉默LKB1以后,苯乙雙胍可以顯著誘導(dǎo)膽管癌細(xì)胞凋亡,而二甲雙胍則不明顯。
　　 結(jié)論:
　　 LKB1的缺失在肝門(mén)部膽管癌中是一個(gè)普遍現(xiàn)象,它的缺失與肝門(mén)部膽管癌臨床預(yù)后差呈明顯