多重PCR檢測水產品中四種食源性致病菌的研究與檢測試劑盒的開發(fā).pdf

1、我國足水產品的生產和消費大國,已成為世界水產品行業(yè)的支柱,而水產品在養(yǎng)殖、捕撈、儲藏、加工、運輸、銷售等環(huán)節(jié)容易受到病原微生物的污染,因此病原微生物檢測是水產品及其加工品衛(wèi)生檢測中的一項重要工作,其關系到消費者的健康及生命安全。其中沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌和金黃色葡萄球菌被認為是重要的污染水產品的致病菌,已引起各個國家衛(wèi)生檢測部門及疾病控制中心的廣泛重視。我國標準DB11/519-2008《生食水產品衛(wèi)生要求》規(guī)定致病菌不

2、得檢出。然而傳統(tǒng)致病菌檢測方法存在檢測時間長,一般檢測周期在5-10天,檢測程序繁瑣,工作量大等缺點,因此亟需建立一種操作簡便、快速準確、靈敏度和特異性都較高的現(xiàn)代化檢測方法,以滿足現(xiàn)代化食品安全快速檢測的需要。
　　 本研究旨在利用多重PCR技術系統(tǒng)地建立水產品及其加工制品中沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌和志賀氏菌四種常見食源性致病菌的快速檢測方法,對此方法進行優(yōu)化和評價,并基于此方法開發(fā)出可用于實際水產品及其加工制品

3、的目標致病菌檢測的SSSVm-PCR檢測試劑盒,具體實驗內容和結果如下:
　　 1.設計制備一種能夠同時富集沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌的復合共增菌培養(yǎng)基SSSV,用于水產品中上述常見四種食源性致病菌的同時快速增菌。以緩沖蛋白胨水為基礎培養(yǎng)基,通過挑選適合的促進劑、抑制劑及營養(yǎng)物質進行單岡素試驗和正交試驗,確定其最佳成分及配比;分析了SSSV培養(yǎng)基對目標菌的生長選擇性及生長特性,并通過Gompertz方程構建

4、生長模型,獲得四種目標菌在SSSV中的對數(shù)生長率(EGR)、傳代時間(GT)、停滯期(LPD)及最大菌落密度(MPD)四個生長特性參數(shù);通過人工污染試驗,分析了SSSV對不同貯藏條件下的水產品中目標致病菌的修復能力,最后比較了SSSV與營養(yǎng)肉湯及國標中各自選擇性增菌液對實際水產樣品的檢測效果。結果表明,獲得的共增菌培養(yǎng)基SSSV對非目標菌表現(xiàn)出一定的抑制性,能同時富集不同接種比例組成的混合菌,37℃培養(yǎng)8 h后,菌體濃度均可達到104-

5、107 CFU/mL;SSSV能有效修復冷藏和凍藏水產品中冷受傷的目標致病菌,人工污染102CFU/mL目標菌的冷藏和冷凍蝦仁、目魚卷及魚丸樣品經(jīng)SSSV培養(yǎng)基在37℃分別培養(yǎng)8 h和12h可使菌體濃度達到105-106 CFU/mL;SSSV對實際水產樣品中四種致病菌的增菌效果優(yōu)于營養(yǎng)肉湯,但略差于國標中目標菌各自選擇性增蔭液。V2、篩選出金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的耐熱核酸酶基因nuc、沙門氏菌(S

6、almonella spp.)的侵襲蛋白基因invA、志賀氏菌(Shigella spp.)的侵染性質?？乖璈基因ipaH和副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)的毒力表達調控基因toxR作為目標靶基因并設計相應引物對,建立并優(yōu)化了一種快速檢測水產品中上述四種常見食源性致病菌的多重:PCR方法。結果顯示,沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌及副溶血性弧菌的多重PCR擴增片段產物大小分別為549 bp、426 bp、3

7、48 bp、243 bp,通過序列測序及BLAST比對證明了擴增產物的準確性;該檢測方法具有良好的特異性和靈敏度,四種目標菌的檢測限分別為志賀氏菌和金黃色葡萄球菌102CFU/mL,沙門氏菌和副溶血性弧菌為101 CFU/mL。SSSV富集培養(yǎng)與該多重PCR方法聯(lián)用,對50份實際水產樣品進行檢測,并與國標方法對比驗證得出,四種致病菌的整體檢測符合率達97％以上,兩種檢測方法無顯著性差異(P＞0.05),但檢測時間大幅縮短,可在24 h內

8、完成樣品的檢驗。
　　 3、實現(xiàn)了對上述多重PCR檢測方法的產品化組裝,開發(fā)成適合快速檢測水產品中沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌和副溶血性弧菌的檢測試劑盒SSSV m-PCR Kit。對該試劑盒的保存方式,穩(wěn)定性及重復性進行了測定和評價。結果表明,該實際盒檢測效果穩(wěn)定,可重復性好,4℃保存條件下最長可30 d-60 d,在-20℃或-80℃條件保存,其保質期可接近或達到一年,但試劑的反復凍融對試劑盒的檢測效果影響較大,使用者