迷迭香酸對(duì)CUS大鼠抑郁樣行為的改善作用及其機(jī)制研究.pdf

1、研究目的：
　　本研究的主要目的是應(yīng)用慢性不可預(yù)見應(yīng)激（chronic unpredictable stress，CUS）的大鼠模型進(jìn)行研究，探討迷迭香酸（Rosmarinic acid，RA）對(duì)CUS大鼠抑郁樣行為的改善作用以及對(duì)大鼠海馬區(qū)域細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular-regulated kinase，ERK）信號(hào)傳遞的改變，海馬的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic fa

2、ctor，BDNF）、膠質(zhì)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF）水平的調(diào)節(jié)是否是RA改善CUS模型大鼠抑郁樣行為的基礎(chǔ)。此外，本研究還通過離體研究觀察了RA對(duì)海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞活力、增殖的作用以及對(duì)其ERK1/2磷酸化水平和BDNF、GDNF表達(dá)的影響，以進(jìn)一步探討RA發(fā)揮抗抑郁作用的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。
　　研究方法：
　　1、觀察RA干預(yù)對(duì)CUS抑郁模型

3、大鼠的抑郁樣行為及海馬ERK1/2磷酸化水平和BDNF、GDNF表達(dá)的影響。
　　雄性Sprague–Dawley（SD）大鼠被隨機(jī)分為6組，每組16只：（1）對(duì)照組（sham+ vehicle），實(shí)驗(yàn)大鼠常規(guī)飼養(yǎng)2周后，每天腹腔注射生理鹽水，連續(xù)2周；（2）對(duì)照+RA低劑量組（sham+RA(L)），實(shí)驗(yàn)大鼠常規(guī)飼養(yǎng)2周后，每天腹腔注射RA（5 mg/Kg體重），連續(xù)2周；（3）對(duì)照+RA高劑量組（sham+RA(H)），實(shí)驗(yàn)大

4、鼠常規(guī)飼養(yǎng)2周后，每天腹腔注射RA（10 mg/Kg體重），連續(xù)2周；（4）模型組（CUS+vehicle），大鼠接受為期3周的慢性不可預(yù)見應(yīng)激，從第3周干預(yù)開始，每天腹腔注射生理鹽水，連續(xù)2周；（5）模型+RA低劑量組（CUS+RA(L)），大鼠接受為期3周的慢性不可預(yù)見應(yīng)激，從第3周干預(yù)開始，每天腹腔注射RA（5 mg/Kg體重），連續(xù)2周；（6）模型+RA高劑量組（CUS+RA(H)），大鼠接受為期3周的慢性不可預(yù)見應(yīng)激，從第3周

5、干預(yù)開始，每天腹腔注射RA（10 mg/Kg體重），連續(xù)2周。RA干預(yù)結(jié)束后，對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中的部分大鼠（每組8只，共計(jì)48只）進(jìn)行強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)和曠場實(shí)驗(yàn)、測試后，提取大鼠的海馬組織蛋白樣品，分別檢測 BDNF、GDNF、ERK1/2、pERK1/2的水平。其余8只大鼠進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)。
　　2、應(yīng)用ERK磷酸化抑制劑U0126干預(yù)后，觀察RA干預(yù)對(duì)CUS抑郁模型大鼠的抑郁樣行為及海馬ERK1/2磷酸化水平和BDNF表達(dá)的作用。

6、　　結(jié)合第一部分實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，實(shí)驗(yàn)二仍然分為6組，每組16只：（1）對(duì)照組（sham+ vehicle），實(shí)驗(yàn)大鼠常規(guī)飼養(yǎng)2周后，每天腹腔注射生理鹽水，連續(xù)2周，并且在注射生理鹽水前30 min注射對(duì)照溶劑（0.6 mL/Kg體重）；（2）對(duì)照+U0126組（sham+ U0126），實(shí)驗(yàn)大鼠常規(guī)飼養(yǎng)2周后，每天腹腔注射生理鹽水，連續(xù)2周，并且在注射生理鹽水前30 min注射U0126（0.5 mg/Kg體重）；（3）模型組（CUS+ve

7、hicle），大鼠接受為期3周的慢性不可預(yù)見應(yīng)激，從第3周干預(yù)開始，每天腹腔注射生理鹽水，連續(xù)2周，并且在注射生理鹽水前30 min注射對(duì)照溶劑（0.6 mL/Kg體重）；（4）模型組+U0126組（CUS+U0126），大鼠接受為期3周的慢性不可預(yù)見應(yīng)激，從第3周干預(yù)開始，每天腹腔注射生理鹽水，連續(xù)2周，并且在注射生理鹽水前30 min注射U0126（0.5 mg/Kg體重）；（5）模型+RA高劑量組（CUS+RA(H)），大鼠接受為

8、期3周的慢性不可預(yù)見應(yīng)激，從第3周干預(yù)開始，每天腹腔注射RA（10 mg/Kg體重），連續(xù)2周，并且在注射生理鹽水前30 min注射對(duì)照溶劑（0.6 mL/Kg體重）；（6）模型+RA高劑量+U0126組（CUS+RA(H)+U0126），大鼠接受為期3周的慢性不可預(yù)見應(yīng)激，從第3周干預(yù)開始，每天腹腔注射RA（10 mg/Kg體重），連續(xù)2周，并且在注射生理鹽水前30 min注射U0126（0.5 mg/Kg體重）。對(duì)照溶劑為二甲基亞砜

9、（Dimethyl sulfoxide，DMSO）水溶液（DMSO：生理鹽水=1：4）。與第一部分實(shí)驗(yàn)指標(biāo)相同，干預(yù)結(jié)束后對(duì)部分大鼠（每組8只）進(jìn)行強(qiáng)迫游泳和曠場實(shí)驗(yàn)測試后，取其海馬組織蛋白樣品，分別檢測BDNF、ERK1/2、pERK1/2的水平。其余大鼠進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)。
　　3、原代培養(yǎng)海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞，觀察不同劑量 RA對(duì)該細(xì)胞活力、ERK1/2磷酸化水平和BDNF表達(dá)的影響。并在此基礎(chǔ)上添加U0126，觀察不同劑量RA對(duì)星

10、形膠質(zhì)細(xì)胞ERK1/2磷酸化水平和BDNF表達(dá)的影響。
　　通過原代培養(yǎng)的方法獲得新生SD大鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞，經(jīng)純度鑒定后，接種于96或6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待貼壁牢固后，加入不同濃度的RA（RA經(jīng)DMEM稀釋后，配置成10、50、100、200和400μg/mL的10×母液，在原培養(yǎng)體系中加入培養(yǎng)液1/10的母液即可達(dá)到終濃度，對(duì)照組加入相應(yīng)體積的DMEM），作用48 h后，通過WST-1方法檢測細(xì)胞活力，通過BrdU摻入實(shí)驗(yàn)觀察

11、RA對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖的作用，同時(shí)取細(xì)胞上清液檢測BDNF釋放的情況，并且提取蛋白，用Western blot方法檢測ERK1/2，pERK1/2的表達(dá)情況。另一部分星形膠質(zhì)細(xì)胞在培養(yǎng)體系中加入U(xiǎn)0126（終濃度2μM）,接種方式和檢測指標(biāo)同前。
　　4、原代培養(yǎng)海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞，觀察不同劑量RA對(duì)該細(xì)胞活力、增殖情況和GDNF表達(dá)的影響。
　　海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)純度鑒定后，接種于96或24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待貼壁牢固后，加入

12、不同濃度的RA（RA經(jīng)DMEM稀釋后，配置成10、50、100、200和400μg/mL的10×母液，在原培養(yǎng)體系中加入培養(yǎng)液1/10的母液即可達(dá)到終濃度，對(duì)照組加入相應(yīng)體積的DMEM），作用48 h或72 h后，取細(xì)胞上清液檢測GDNF釋放的情況。并且在作用72 h后，通過WST-1方法檢測細(xì)胞活力，通過BrdU摻入實(shí)驗(yàn)觀察RA對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖的作用。
　　結(jié)果：
　　實(shí)驗(yàn)一部分顯示，大鼠經(jīng)CUS處理后表現(xiàn)出明顯的抑郁樣

13、行為并且海馬磷酸化ERK1/2的表達(dá)和BDNF、GDNF的水平均下調(diào)；而經(jīng)RA干預(yù)后，抑郁模型大鼠的抑郁樣行為得到改善并且海馬磷酸化ERK1/2的表達(dá)和BDNF、GDNF的水平上調(diào)。具體如下：
　　1．與對(duì)照處理相比，CUS處理后大鼠：（1）在曠場實(shí)驗(yàn)中，水平運(yùn)動(dòng)距離減少（P<0.01）；（2）強(qiáng)迫實(shí)驗(yàn)中的大鼠不動(dòng)時(shí)間延長（P<0.01）；（3）Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中，在目標(biāo)象限停留時(shí)間縮短（P<0.01）；（4）Western

14、 blot檢測結(jié)果顯示，海馬ERK1/2的表達(dá)沒有顯著影響，但是抑制了pERK1/2的表達(dá)（P<0.01）；（5）Elisa結(jié)果顯示，海馬BDNF、GDNF水平下降（均為P<0.01）。
　　2.與CUS組相比，經(jīng)高劑量RA（10 mg/Kg體重）治療后的大鼠：（1）在曠場實(shí)驗(yàn)中，水平運(yùn)動(dòng)距離增加（P<0.05）；（2）強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間縮短（P<0.05）；（3）水迷宮實(shí)驗(yàn)中，在目標(biāo)象限停留時(shí)間延長（P<0.05）；（4）West

15、ern blot檢測結(jié)果顯示，海馬ERK1/2的表達(dá)沒有顯著影響，但是pERK1/2的表達(dá)上調(diào)（P<0.05）；（5） Elisa結(jié)果顯示，海馬BDNF、GDNF水平上調(diào)（均P<0.05）。
　　實(shí)驗(yàn)二部分，研究發(fā)現(xiàn)RA對(duì)抑郁動(dòng)物行為的改善作用可以被U0126所阻斷，而且Western Blot的結(jié)果也顯示U0126不僅抑制了RA對(duì)抑郁動(dòng)物海馬ERK1/2磷酸化的上調(diào)作用，而且抑制了其對(duì)BDNF的調(diào)節(jié)作用。具體如下：
　　1

16、.雙因素方差分析結(jié)果顯示，造模與否（sham vs. CUS）在曠場實(shí)驗(yàn)的水平運(yùn)動(dòng)距離（F=27.088，P=0.000），強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間（F=15.924，P=0.000）以及水迷宮實(shí)驗(yàn)中，在目標(biāo)象限停留時(shí)間（F=28.233，P=0.000）均存在顯著性差異。此外，各干預(yù)因素（包括對(duì)照溶劑、U0126、RA以及RA+U0126）之間對(duì)動(dòng)物行為學(xué)的作用也存在顯著性差異，包括曠場實(shí)驗(yàn)的水平運(yùn)動(dòng)距離（F=3.247，P=0.031），強(qiáng)

17、迫游泳不動(dòng)時(shí)間（F=3.981，P=0.014）以及水迷宮實(shí)驗(yàn)中，在目標(biāo)象限停留時(shí)間（F=3.800，P=0.017）；而且處理方式和干預(yù)這兩種處理對(duì)上述三項(xiàng)行為學(xué)指標(biāo)的影響不存在交互作用。進(jìn)一步多重比較發(fā)現(xiàn)，RA高劑量組與RA高劑量+U0126在上述三項(xiàng)行為學(xué)檢測指標(biāo)中均存在顯著性差異（P<0.05）。
　　2.實(shí)驗(yàn)二也觀察了不同處理方式和干預(yù)因素對(duì)海馬pERK1/2和BDNF的水平的影響。其中，造模與否之間pERK1/2的表達(dá)

18、（F=30.712，P<0.001）和BNDF的水平（F=18.920，P=0.001）存在顯著差異；不同干預(yù)方式之間pERK1/2的表達(dá)（F=4.772，P=0.008）和BNDF的水平（F=2.646，P=0.041）也存在顯著差異。造模與否與不同干預(yù)方式之間不存在交互作用。多重比較結(jié)果顯示，RA高劑量組與RA高劑量+U0126在pERK1/2的表達(dá)和BNDF的水平中均存在顯著性差異（P<0.05）。
　　實(shí)驗(yàn)三部分，通過原代

19、培養(yǎng)獲得星形膠質(zhì)細(xì)胞，在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入不同劑量的RA作用48 h，結(jié)果顯示：直接給予不同劑量RA對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞活力（F5,30=0.456，P=0.806）和增殖水平（F5,20=0.766，P=0.912）并沒有顯著作用；對(duì)ERK1/2的表達(dá)也沒有顯著影響（F5,24=0.098，P=0.992），但是對(duì)pERK1/2（F5,24=3.147，P=0.025）以及BDNF（F5,30=2.615，P=0.045）的表達(dá)卻存在顯著

20、差異。多重比較結(jié)果顯示，在劑量為20μg/mL或40μg/mL時(shí)卻可以促進(jìn)ERK磷酸化水平，而且在劑量為20μg/mL的情況下還可以促進(jìn)BDNF的釋放。經(jīng)過U0126干預(yù)后，經(jīng)雙因素方差分析，星形膠質(zhì)細(xì)胞ERK1/2的表達(dá)沒有顯著變化（F=0.245，P=0.992），但是對(duì)pERK1/2（F=0.591，P<0.001）以及BDNF（F=22.277，P<0.001）的表達(dá)卻存在顯著影響。而且不同RA劑量+U0126組之間均沒有顯著性

21、差異（P>0.05）。
　　實(shí)驗(yàn)四部分，通過原代培養(yǎng)獲得星形膠質(zhì)細(xì)胞，在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入不同劑量的RA作用48 h或72 h，結(jié)果顯示：直接給予不同劑量RA作用72 h對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞活力（F5,30=0.351，P=0.0306）和增殖水平（F5,25=6.693，P<0.01）均具有促進(jìn)作用；對(duì)BDNF（F5,30=3.251，P=0.016）的水平也具有促進(jìn)作用。多重比較結(jié)果顯示，在劑量為20μg/mL或40μg/mL時(shí)可

22、以促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖，而且在劑量為20μg/mL的情況下還可以促進(jìn)其細(xì)胞活力和GDNF的釋放。
　　結(jié)論：
　　CUS模型大鼠表現(xiàn)明顯的抑郁樣行為，而一定劑量的RA干預(yù)能改善這一行為表現(xiàn)，并且緩解由CUS所致海馬pERK1/2和BDNF、GDNF水平下降的情況，但是，應(yīng)用ERK磷酸化抑制劑U0126可以阻斷上述效應(yīng)；一定劑量的RA還可以促進(jìn)海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞ERK磷酸化和BDNF的表達(dá)，這一作用同樣可以被U0126阻斷；此外