miR-137對卒中后抑郁大鼠模型的治療作用及其作用機(jī)制研究.pdf

1、卒中后抑郁(post-stroke depression，PSD)是腦卒中后最常見的心理行為障礙并發(fā)癥，在卒中患者中的發(fā)病率約為25％-79％。PSD具體發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，給治療帶來極大的困難。最新研究表明，miRNA可能在抑郁癥的發(fā)生、發(fā)展中扮演著重要的角色，可以作為抑郁癥臨床治療的潛在靶點(diǎn)。作為抑郁癥中的特殊一種，PSD的發(fā)病是否也與miRNA相關(guān)昵？腦卒中患者外周血檢測發(fā)現(xiàn)，有多種miRNA在急性期出現(xiàn)上調(diào)或下降，隨后在鼠類缺

2、血模型中的研究證實(shí)了腦內(nèi)也出現(xiàn)了相應(yīng)的miRNA變化。令人感興趣的是，在腦缺血后下調(diào)的miRNA和抑郁癥患者下調(diào)的miRNA有著部分的重疊，但這些重疊的miRNA在PSD的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮的作用尚無人研究。因此，本實(shí)驗(yàn)選取miR-137為對象，研究其對PSD大鼠模型行為學(xué)的影響，旨在為PSD發(fā)病機(jī)制和治療藥物的研究提供新的思路。
　　第一部分、大腦中動脈阻塞法結(jié)合慢性溫和刺激建立卒中后抑郁大鼠模型
　　目的:建立卒中后抑郁大鼠

3、模型，為疾病的研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法:篩選體重180～210 g的清潔級健康SD大鼠，雌雄各半，正常飼養(yǎng)1周適應(yīng)環(huán)境，監(jiān)測并記錄大鼠體重、蔗糖水消耗量、水平活動得分及垂直運(yùn)動得分。平均分為3組:對照組、卒中組與PSD（缺血加應(yīng)激）組，采用大腦中動脈阻塞法(middlecerebral artery occlusion，MCAO)制作腦缺血再灌注模型，模型成功后選取Longa評分≥1并＜4的大鼠，通過慢性溫和刺激（chroni

4、c mild stress，CMS）建立PSD模型。分別采用糖水消耗試驗(yàn)、曠野試驗(yàn)(open-field test，OFT)評估大鼠快感缺失、活動減少、行為絕望等行為。
　　結(jié)果:與對照組相比，PSD組大鼠體重的增長明顯滯緩，于7d時PSD組大鼠體重開始低于對照組(P＜0.05)，于14d時體重低于卒中組(P＜0.05)。隨著時間變化，PSD組大鼠蔗糖水消耗比例逐漸下降。與對照組相比，14d和21 d時PSD組大鼠蔗糖水消耗量明顯

5、降低(P＜0.05)，并且在21d時PSD組大鼠蔗糖水消耗比例低于卒中組(P＜0.05)。隨時間變化，PSD組大鼠水平得分逐漸下降，至21d時仍呈下降趨勢，各時間段水平得分均小于對照組(P＜0.05)。21d時，PSD組大鼠腦組織中NE、DA和5-HT含量均明顯低于對照組(P＜0.05)。
　　結(jié)論:PSD模型大鼠較充分而持續(xù)表現(xiàn)快感缺乏、活動減少等“抑郁”核心癥狀，可操作性和重復(fù)性較好，是研究PSD較為理想的大鼠模型。
　

6、　第二部分、miR-137在PSD大鼠腦內(nèi)的表達(dá)及其治療作用
　　目的:觀察microRNA在PSD大鼠腦內(nèi)的表達(dá)及其對PSD大鼠的治療作用。
　　方法:①取正常大鼠、MCAO大鼠和PSD大鼠處死取腦，microarray檢測差異microRNA表達(dá)，并對表達(dá)差異的microRNA進(jìn)行qRT-PCR檢測驗(yàn)證;②并選取24只SD大鼠入組:6只大鼠不作任何處理（control組）、6只大鼠經(jīng)MCAO+CMS制作PSD模型（PSD

7、組）、6只大鼠經(jīng)MCAO+腦室注射agomir-137+CMS(agomir-137組)、6只大鼠經(jīng)MCAO+腦室注射agomir-NC+CMS（agomir-NC組），對各組大鼠進(jìn)行行為學(xué)檢測。
　　結(jié)果:①microarray檢測結(jié)果顯示，與正常大鼠相比，PSD大鼠腦內(nèi)多種microRNA表達(dá)上調(diào)或下調(diào)，如miR-137，miR-124，miR-181和miR-145等。qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果與microarray結(jié)果相符。P

8、SD大鼠腦內(nèi)和外周血中miR-137表達(dá)水平均明顯低于正常大鼠(p＜0.05)。②曠野實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在腦缺血第3w，經(jīng)腦室注射agomir-137的PSD大鼠垂直得分以及水平得分均顯著高于agomir-NC組大鼠以及普通PSD大鼠(p＜0.05)。糖水消耗實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在腦缺血后第2 w末起，agomir-137組大鼠糖水消耗百分比即顯著高于agomir-NC組大鼠以及普通PSD大鼠(p＜0.05)。
　　結(jié)論:①多種microR

9、NA可能參與PSD的病理生理過程，其中以miR-137作用比較明顯;②人為增強(qiáng)內(nèi)源性miR-137表達(dá)可以發(fā)揮抗PSD的作用。
　　第三部分、miR-137通過抑制Grin2A表達(dá)發(fā)揮對卒中后抑郁大鼠模型的治療作用
　　目的:尋找miR-137治療PSD的作用靶點(diǎn)。
　　方法:①為揭示miR-137對卒中后抑郁大鼠模型的治療作用機(jī)制，我們通過pictar、microbase和targetscan三個數(shù)據(jù)庫尋找miR-1

10、37的作用靶點(diǎn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Grin2A基因的3'UTR端包含一個7 mer大小的序列與miR-137相匹配;②為驗(yàn)證miR-137影響Grin2A的蛋白表達(dá)，我們將agomir-137及其陰性對照agomir-NC、antagomir-137及其陰性對照antagomir-NC轉(zhuǎn)染至PC12細(xì)胞中，western blot檢測Grin2A水平差異。③為確定Grin2A基因的3'UTR端包含的7 mer大小的序列與miR-137結(jié)合后可下調(diào)

11、Grin2A mRNA的翻譯，我們將含此位點(diǎn)的Grin2A mRNA3'UTR構(gòu)建入luciferase報(bào)告系統(tǒng)(Grin2A-3'UTR-wt)，同時將突變后的Grin2A mRNA3'UTR也插入luciferase報(bào)告系統(tǒng)中(Grin2A-3'UTR-mut)。然后將miR-137與luciferase空質(zhì)粒(empty vector)或Grin2A-3'UTR-wt質(zhì)?；騁rin2A-3'UTR-mut質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染至HEK-29

12、3細(xì)胞中，檢測各組細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度。④為檢測Grin2A是否參與miR-137抗PSD作用，12只大鼠被添加入組:6只大鼠經(jīng)MCAO+腦室注射AAV9-CMV-Grin2A質(zhì)粒和agomir-137+CMS（agomir-137+Grin2A），6只大鼠經(jīng)MCAO+腦室注射空質(zhì)粒和agomir-137+CMS(agomir-137+vector)，并對所有組大鼠進(jìn)行行為學(xué)檢測。
　　結(jié)果:①miR-137 mimic可顯著降低PC

13、12細(xì)胞中Grin2A水平(p＜0.05)，而miR-137inhibitor可顯著升高PC12細(xì)胞中Grin2A水平(p＜0.05)。②Grin2A-3'UTR-wt組熒光強(qiáng)度明顯低于其陰性對照組(miR-con)，而Grin2A-3'UTR-mut組或空質(zhì)粒組熒光強(qiáng)度與其陰性對照無明顯差異。③Grin2A過表達(dá)組(agomir-137+Grin2A)的大鼠垂直得分以及水平得分均明顯低于其陰性對照(agomir-137+vector)

14、和agomir-137組(p＜0.05)。并且Grin2A過表達(dá)組蔗糖水消耗百分比明顯低于其陰性對照和agomir-137組(p＜0.05)。
　　結(jié)論: miR-137可以通過與Grin2A mRNA3'UTR端結(jié)合而調(diào)節(jié)其蛋白表達(dá)水平，過表達(dá)Grin2A可阻斷miR-137對PSD大鼠行為學(xué)的影響，證明其參與了miR-137對PSD大鼠的治療作用。
　　全文結(jié)論:
　　1.PSD模型大鼠較充分而持續(xù)表現(xiàn)快感缺乏、活

15、動減少等“抑郁”核心癥狀，可操作性和重復(fù)性較好，是研究PSD較為理想的大鼠模型。
　　2.卒中后抑郁大鼠模型腦內(nèi)和外周血中的miR-137水平明顯下降，上調(diào)腦內(nèi)miR-137水平后可顯著改善PSD模型的行為學(xué)變化。
　　3.miR-137可以與Grin2A的3'UTR端結(jié)合，抑制Grin2A mRNA的翻譯從而下調(diào)其蛋白的表達(dá)，而在卒中后抑郁大鼠模型的腦內(nèi)過表達(dá)Grin2A基因后，miR-137抗卒中后抑郁的作用被顯著減弱，