慢病毒載體介導(dǎo)HBVX基因穩(wěn)定表達(dá)對(duì)HL7702細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)和功能的影響.pdf

1、目的：以慢病毒為載體構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)乙型肝炎病毒X基因(HBVX)的HL7702細(xì)胞株，探討HBVX穩(wěn)定表達(dá)對(duì)HL7702細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)和功能的影響。
　　方法：首先根據(jù)In-Fusion技術(shù)原理設(shè)計(jì)克隆引物，采用PCR技術(shù)從真核質(zhì)粒pcDNA3.1-X中擴(kuò)增出含HBV X基因DNA全長(zhǎng)片段，用In-Fusion交換酶將PCR產(chǎn)物與線性化慢病毒載體質(zhì)粒連接,經(jīng) PCR、測(cè)序、質(zhì)粒表達(dá)檢測(cè)鑒定。將構(gòu)建成功的重組慢病毒質(zhì)粒 PLOV.CM

2、V.eGFP.2A.3×Flag＆HBx.EF1a.Pura與包裝質(zhì)粒psPAX2、包膜質(zhì)粒pMD2.G三質(zhì)粒瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞以包裝慢病毒顆粒，慢病毒顆粒的滴度采用熒光定量PCR的方法檢測(cè)。包裝好的重組慢病毒顆粒感染HL7702細(xì)胞，并經(jīng)過嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)HBV X的細(xì)胞株HL7702/HBx，并經(jīng)過RT-PCR和Western-blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)HL7702/HBx細(xì)胞內(nèi)有HBV X穩(wěn)定持續(xù)的表達(dá)。以半定量RT-PCR方法

3、和Western-blot方法檢測(cè)細(xì)胞色素C氧化酶III(COXIII)表達(dá)水平變化，酶動(dòng)力學(xué)方法檢測(cè)線粒體細(xì)胞色素C氧化酶活性，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平和線粒體跨膜電位，利用激光掃描共聚焦顯微鏡采集熒光信號(hào)觀察COXIII與HBVX蛋白（HBx）在肝細(xì)胞HL7702內(nèi)的定位，掃描電鏡下觀察HL7702/HBx細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)的改變。
　　結(jié)果：成功構(gòu)建表達(dá)3×Flag＆HBx融合基因的重組慢病毒表達(dá)載體，經(jīng)293T細(xì)胞包

4、裝和濃縮后，重組慢病毒滴度為8.61×107IU/ml。慢病毒感染 HL7702細(xì)胞后經(jīng)嘌呤霉素藥物篩選，得到穩(wěn)定表達(dá) HBx的新細(xì)胞株 HL7702/HBx，經(jīng)RT-PCR和Western-blot分析結(jié)果顯示HL7702/HBx細(xì)胞能夠持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)HBx。HBx在細(xì)胞漿和細(xì)胞核中表達(dá)，而細(xì)胞漿中HBx可分布于線粒體，并與COXIII共定位表達(dá)。掃描電鏡下發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定表達(dá)HBx的細(xì)胞線粒體較空白對(duì)照組和空載對(duì)照組線粒體脊稍腫脹，細(xì)胞形態(tài)及

5、結(jié)構(gòu)無明顯改變。半定量RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)COXIII mRNA表達(dá)水平無明顯改變，Western-blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明HL7702/HBx細(xì)胞內(nèi)COXIII蛋白表達(dá)上調(diào)，線粒體細(xì)胞色素C氧化酶活性水平升高，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)ROS水平上升，而線粒體跨膜電位沒有發(fā)生明顯改變。
　　結(jié)論：成功構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)HBx的細(xì)胞株HL7702/HBx。細(xì)胞漿中HBx可定位于線粒體并與COXIII相互作用，通過轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)COXIII表達(dá)，從