支架蛋白GIT2參與調(diào)節(jié)免疫性肝損傷的分子機(jī)制研究.pdf

1、G蛋白偶聯(lián)受體激酶相互作用蛋白2(G protein-coupled receptor kinase interacting proteins2,GIT2)是一種多結(jié)構(gòu)域的信號支架蛋白,屬于ARF GTPase-激活蛋白(ARF GTPase-activating protein,Arf GAPs)家族。Git2基因敲除小鼠表現(xiàn)為骨髓外造血、脾腫大、髓性粒細(xì)胞增加、肺部淋巴細(xì)胞浸潤增加、對病原體感染的敏感性增加等多種免疫缺陷癥狀。大量研

2、究表明,GIT2與免疫系統(tǒng)有著密切的關(guān)系:GIT2缺失可導(dǎo)致中性粒細(xì)胞的細(xì)胞趨化方向感應(yīng)受損和超氧化物的過量產(chǎn)生;在TCR轉(zhuǎn)基因Git2-/-小鼠胸腺中,CD4+CD8+T細(xì)胞向CD4+CD8-T細(xì)胞的發(fā)育過程受損,導(dǎo)致CD4+CD8-T細(xì)胞比例降低。這些都提示GIT2在機(jī)體的天然免疫和獲得性免疫系統(tǒng)中具有重要功能。此外還有證據(jù)表明,GIT2能與αPIX、PAK1形成三分子復(fù)合體,在TCR通路中以獨(dú)立于LAT、SLP-76、Nck和Ra

3、c的TCR調(diào)節(jié)替代途徑激活PAK1,并由αPIX將PAK1靶定位在免疫突觸發(fā)揮作用。實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)Git2基因敲除小鼠能夠抵抗刀豆蛋白A(Concanavalin A,Con A)誘發(fā)的急性免疫性肝損傷,因此我們推測GIT2可能參與調(diào)節(jié)免疫性肝損傷的發(fā)生發(fā)展過程。
　　我們分離Git2敲除小鼠脾臟單個核細(xì)胞,并分選出CD3+和CD4+T細(xì)胞,體外刺激后檢測細(xì)胞的增殖及細(xì)胞因子分泌情況;針對Con A主要作用于T細(xì)胞受體的機(jī)制,

4、研究GIT2缺失對TCR通路活化的影響,包括信號分子的磷酸化、細(xì)胞骨架重塑、免疫突觸的形成以及 Rac/Cdc42小 GTPase活性。結(jié)果表明,GIT2缺失降低T淋巴細(xì)胞體外增殖和細(xì)胞因子的分泌;GIT2缺失不影響經(jīng)典TCR通路的活化,但影響GIT2-αPIX-PAK1三聚體的形成,并且F-actin在免疫突觸部位的聚集及帽型結(jié)構(gòu)的形成受損。此外,我們還發(fā)現(xiàn)GIT2缺失降低了αPIX的穩(wěn)定性,并導(dǎo)致其泛素化降解,PAK1抑制劑IPA-

5、3能夠抑制野生型小鼠T淋巴細(xì)胞的增殖與活化。由此我們推斷,由于GIT2的缺失導(dǎo)致αPIX的蛋白水平下調(diào),致使GIT2-αPIX-PAK1介導(dǎo)的TCR非經(jīng)典途徑受損,PAK1不能被有效磷酸化,減弱免疫性肝損傷中T細(xì)胞的活化和細(xì)胞因子分泌,而表現(xiàn)出保護(hù)作用。
　　此外,由于GIT2在損傷的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞中高表達(dá),我們對Con A誘導(dǎo)的Git2+/+和Git2-/-小鼠急性肝損傷的肝組織中的重要分子表達(dá)變化進(jìn)行了研究,包括信號通路的變化、效

6、應(yīng)基因的表達(dá)變化等。結(jié)果表明在 Con A致?lián)p的Git2-/-小鼠肝臟中NF-κB通路活化增加,ERK和Smad3的磷酸化受到抑制,JNK磷酸化提前但持續(xù)時間較短。實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)GIT2可通過募集A20影響NEMO的泛素化發(fā)揮其對NF-κB的負(fù)調(diào)控作用。因此我們利用Real-Time PCR技術(shù)研究了Con A致?lián)p小鼠肝組織中GIT2對NF-κB通路下游靶基因的表達(dá)變化,結(jié)果表明GIT2缺失導(dǎo)致 NF-κB通路下游靶基因的轉(zhuǎn)錄水平增

7、加。前期酵母雙雜交篩庫中我們發(fā)現(xiàn)Smad3是GIT2的一個候選相互作用分子,并且已有研究表明,Smad3敲除小鼠能夠免受Con A誘導(dǎo)的免疫性肝損傷,因此我們用免疫共沉淀驗(yàn)證了GIT2與Smad3的相互作用,并發(fā)現(xiàn)GIT2可增加Smad3介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活性。
　　本研究從T淋巴細(xì)胞和肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞兩個方面揭示了GIT2在免疫性肝損傷發(fā)生發(fā)展過程中不同的作用機(jī)制。在T淋巴細(xì)胞中,GIT2與αPIX、PAK1形成三聚體,參與介導(dǎo)TCR的非經(jīng)典