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文檔簡介
1、研究背景:
蛋白尿既是腎臟損傷的標志和臨床治療指標,也是腎小球疾病向小管損傷、間質纖維化進展并最終發(fā)展為尿毒癥期的重要危險因素。腎小球血液濾過屏障自內到外依次包括:①內皮細胞構成的孔窗結構;②高度水化膠原成分的腎小球基底膜(glomerular basement merebrane,GBM);③足細胞足突及由其構成的裂孔隔膜(slit diaphragm,SD)。作為腎小球血液濾過功能的最后屏障,足細胞(podocyte)
2、的改變幾乎參與了所有的蛋白尿相關性腎病的發(fā)生,并在蛋白尿相關性腎臟疾病發(fā)展進程中起著關鍵作用。目前對足細胞分子結構的研究主要集中在①裂孔隔膜復合體(SDs)區(qū),包括:nephrin、podocin、CD2AP、ZO-1;②頂端膜蛋白區(qū):Podocalyxin、GLEPP-1;③基底膜相接觸的基底蛋白區(qū):α3β1整合素、Dystroglycan;④足細胞骨架蛋白:synaptopodin、α-actinin-4、F-actin等。這些對足
3、細胞分子結構的認識從某種程度上為蛋白尿發(fā)生的分子機制提供了依據(jù)。但是對于蛋白尿發(fā)生的足細胞損傷及對其治療有效的分子水平的研究,目前仍無突破性的進展。
最新研究發(fā)現(xiàn):足細胞β3整合素活化、活動增強可導致足突融合和蛋白尿。尿激酶受體(urokinase recepter,uPAR)是β3整合素共受體,其細胞膜內段很短,大部分結構位于細胞表面與整合素及細胞外基質結合。正常情況下,分化成熟的足細胞處于相對靜止狀態(tài),不具有分裂增殖的
4、能力,其表達多種足細胞特有的分子標志物,通過β1整合素粘附于基底膜;而經uPAR途徑的β3整合素活化可直接導致足細胞活動力增強及蛋白尿發(fā)生。Peter Mundel等教授認為(KidInt,2009)蛋白尿發(fā)生涉及到足細胞上一系列酶的分解合成等信號變化,后者最終影響到足細胞的活動及骨架的改變。
環(huán)孢素A(Cyclosporin A,CsA)被廣泛應用于器官移植和免疫性疾病中,是具有里程碑意義的免疫抑制劑。目前,環(huán)孢素A已逐
5、漸應用于各種腎小球疾病,并取得了很好的療效,尤其是環(huán)孢素A能夠有效地降低各種難治性腎病綜合癥中的尿蛋白,然而,其作用機制的研究仍缺少突破性進展。傳統(tǒng)觀點認為,環(huán)孢素A主要通過抑制免疫(作用于T細胞)發(fā)揮抗蛋白尿效應,而目前最新研究發(fā)現(xiàn):壞孢素A降蛋白尿的作用靶點之一是足細胞,這解釋了“為什么在非免疫性。腎臟疾病中環(huán)孢素A仍然能有效降低尿蛋白?”。但是對于環(huán)孢素A在減少蛋白尿發(fā)生及足細胞損傷過程中,究竟扮演著怎樣一個角色仍不清楚。本研究通
6、過建立脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)誘導小鼠蛋白尿模型和經典的5/6腎切除大鼠模型兩個非免疫性蛋白尿模型以及體外脂多糖足細胞損傷模型,觀察環(huán)孢素A對于非免疫因素損傷引起的蛋白尿的影響及環(huán)孢素A對于足細胞p3整合素表達、活化及足細胞遷移力的影響,探討了環(huán)孢素A對于足細胞活動力改變的影響及其降低蛋白尿、穩(wěn)定足細胞進而緩解難治性腎臟疾病中的非免疫性作用,以期闡明環(huán)孢素A降蛋白尿的作用機制。
研究方法
7、> 一、建立非免疫性蛋白尿模型(脂多糖誘導小鼠蛋白尿模型和5/6腎切除大鼠模型),觀察環(huán)孢素A對蛋白尿的影響
(一)脂多糖誘導小鼠蛋白尿模型制作:15只C57BL/6雄性小鼠隨機分為正常對照組(Con)、LPS處理組(LPS)、LPS與CsA共同處理組(LPS+CsA),每組5只,CsA溶入二甲基亞砜(DMSO)-20℃避光保存,LPS溶入生理鹽水4℃保存。LPS組腹腔注射LPS 200ug,并于第二天給予DMSO+
8、生理鹽水灌胃,LPS+CsA 組腹腔注射LPS 200ug,并于第二天給予CsA 25mg.kg-1+DMSO+生理鹽水灌胃,Con組給予等量生理鹽水腹腔注射及DMSO+生理鹽水灌胃。第三天處死動物。
(二)5/6腎切除大鼠模型的制作:24只SD雄性大鼠隨機分為假手術對照組(Sham)、5/6腎切除組(NTX)、5/6腎切除+低劑量CsA干預組(NTX+CsA1)、5/6腎切除+高劑量CsA干預組(NTX+CsA2)。NT
9、X+CsA1組行5/6腎切除手術,一周后每日給予CsA 1mg·kg-1灌胃,NTX+CsA2組行5/6腎切除手術,一周后每日給予CsA5mg.kg-1 灌胃,NTX組行5/6腎切除手術,一周后每日給予等量DMSO灌胃,Sham組行假手術,一周后每日給予等量DMSO灌胃。
(三)時間點設置及24小時尿蛋白檢測和腎組織觀察:脂多糖誘導小鼠蛋白尿模型于第2天留取24h尿液檢測蛋白濃度及尿肌酐濃度后處死并留取腎組織,5/6腎切除
10、大鼠模型分別于2周、4周、8周、12周留取24小時尿液檢測尿蛋白量后處死并耿腎組織。
(四)脂多糖誘導小鼠蛋白尿模型中腎組織切片激光共聚焦觀察synaptopodin、活化p3整合素表達。
二、足細胞培養(yǎng)、鑒定及實驗分組
(一)足細胞培養(yǎng):條件永生性小鼠足細胞由Baylor醫(yī)學院Danesh教授惠贈。首先在5%C02,33℃培養(yǎng)箱環(huán)境,用含20.100U·mL-1 IFN-γ的RPMI 1640
11、和10%FBS放入Ⅰ型膠原包被的培養(yǎng)瓶中共孵育,使其獲得增殖能力。然后轉入5%CO2,37℃培養(yǎng)箱,用不含IFN-γ的DMEM加10%FBS共孵育,經10-14天的培養(yǎng)誘導,足細胞進入分化階段并最終分化成熟。
(二)足細胞鑒定及形態(tài)學觀察:分別對33℃含IFN-γ培養(yǎng)及37℃不含IFN-γ培養(yǎng)10-14天分化成熟后的足細胞在相差顯微鏡下直接拍片,觀察其形態(tài)學差異;表達足細胞骨架蛋白synaptopodin的細胞為分化成熟的
12、足細胞,未分化的足細胞不表達synaptopodin蛋白。
(三)按以下分組干預處理足細胞:
①正常對照組(Con):不加任何干預因素分化成熟的足細胞;
②LPS組(LPS):50-mg-L-1脂多糖與成熟足細胞共同孵育24h:
③CsA處理組(LPS+CsA):用50·mg.L-1脂多糖及0.5mg.T-1環(huán)孢素 A 共同干預24h;
三、總β3整合素及其活化以及u
13、PAR的表達
分別用免疫熒光、流式細胞術及定量PCR檢測β3整合素合成、活化及uPAR表達的變化。
四、足細胞活動力檢測
(一)轉板遷移測定法(Transwell migration assay):使用龍膽紫染色后,在倒置顯微鏡下攝片,觀察正常對照組、LPS處理組及LPS與CsA共同干預組足細胞遷移的變化。
(二)刮除法(Wound healing assay):在Ⅰ型膠原包被的六
14、孔板爬片上培養(yǎng)細胞后,刮除細胞后給予不同的處理,觀察正常對照組、LPS處理組及LPS與CsA共同干預組足細胞損傷修復的變化情況。
五、統(tǒng)計學處理計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差((x)±s)表示,應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析,結果用單因素方差分析(One-way ANOVA)方法,方差齊性用LSD法進行組間多重比較,方差不齊用Dunnett’s T3法進行組間多重比較。P<0.05被定為有統(tǒng)計學差異。
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