低溫脅迫下茶樹花粉管相關(guān)基因的分離與表達(dá)分析.pdf

1、茶樹(Camelliasinensis(L.)O.Kuntze），原產(chǎn)于熱帶及亞熱帶，是一種喜暖喜濕的葉用植物。近年來(lái)全球氣候變化異常，春茶頻繁的遭遇低溫災(zāi)害，進(jìn)而造成產(chǎn)量減少、品質(zhì)下降和上市時(shí)間推后等問題，嚴(yán)重影響了春季名優(yōu)茶的生產(chǎn)和經(jīng)濟(jì)效益。與大多其它被子植物花粉（如百合）不同，茶樹花粉管在低溫下仍能萌發(fā)、生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)利用cDNA-AFLP的方法進(jìn)行茶樹花粉管低溫脅迫下基因差異表達(dá)分析，獲得低溫脅迫下表達(dá)的差異片段，并對(duì)這些片段進(jìn)行

2、分析，克隆獲得與低溫脅迫下茶樹花粉管生長(zhǎng)相關(guān)的基因，并對(duì)這些基因的序列、生物信息學(xué)及相關(guān)功能進(jìn)行初步分析。具體研究結(jié)果如下:
　　(1)利用cDNA-AFLP技術(shù)構(gòu)建茶樹花粉管低溫脅迫下基因差異表達(dá)圖譜。比較了常溫培養(yǎng)和低溫脅迫下茶樹花粉管基因表達(dá)差異，結(jié)果表明兩者存在明顯差異。選擇性回收了13條差異條帶，克隆測(cè)序，并與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行Blastx比對(duì)，其中有10個(gè)序列與已知功能的蛋白序列有一定程度的相似，有3個(gè)功

3、能未知。其中TDF1與蕪菁(Brassicarapa)的丙酮酸脫氫酶E1α亞基高度相似(91％);TDF2與葡萄(Vitisvinifera)的類鈣調(diào)蛋白CML21具有較高的同源性(87％);TDF4與茶樹的14-3-3蛋白相似;TDF5與蓖麻(Ricinuscommunis)的磷脂酶D有74％相似性;TDF7與葡萄(Vitisvinifera)的硫氧還原蛋白h(1)74％相似;TDF9與矮牽牛(Petuniaxhybrida)的β-半

4、乳糖苷酶相似(71％)。
　　(2)根據(jù)前期獲得的差異片段TDF1，通過(guò)Blastx比對(duì)顯示與其他物種的丙酮酸脫氫酶E1α亞基高度相似，通過(guò)3'RACE/5'RACE分別獲得其3'/5'端序列，從而獲得該基因的cDNA序列全長(zhǎng)，命名為茶樹CsE1α基因，GenBank登錄號(hào)為JQ999982。利用熒光定量PCR技術(shù)分析顯示，該基因在花粉中高度表達(dá);在花粉培養(yǎng)過(guò)程中，CsE1α在花粉萌發(fā)30分鐘時(shí)表達(dá)量最高，即花粉萌發(fā)時(shí)期(水合狀態(tài)

5、），而花粉管生長(zhǎng)時(shí)期（培養(yǎng)1h、2h、3h）其表達(dá)基本保持不變。
　　(3)根據(jù)前期獲得的差異片段TDF2，通過(guò)Blastx比對(duì)顯示與其他物種的類鈣調(diào)蛋白CML21具有較高的同源性，通過(guò)3'RACE/5'RACE分別獲得其3'/5'端序列，從而獲得該基因的cDNA全長(zhǎng)，命名為茶樹CsCML21基因，GenBank登錄號(hào)為JQ999983。熒光定量PCR技術(shù)分析顯示，該基因在花粉中大量表達(dá);在花粉培養(yǎng)過(guò)程中，CsCML21的表達(dá)量在