梨花粉管停止生長與線粒體的關(guān)系研究.pdf

1、線粒體變化及其在花粉管亞尖端的富集對滿足花粉管高速極性生長過程中巨大的能量需求和分配極其重要。但是，在花粉管停止生長過程中，線粒體作用特點尚不清楚。本研究以梨品種‘黃花’、‘豐水’及‘碭山酥梨’為試材，綜合應(yīng)用免疫熒光標(biāo)記、激光共聚焦顯微鏡、透射電鏡、亞細胞器制備分離等技術(shù)手段，研究了線粒體對離體培養(yǎng)梨花粉管衰老和死亡的作用特點，主要結(jié)果如下:
　　1.探明了梨自花花粉管線粒體呼吸代謝及可溶性蛋白變化。結(jié)果表明，梨自花花粉管呼吸氧

2、消耗量顯著降低。對提純的自花花粉管線粒體呼吸鏈進行檢測，發(fā)現(xiàn)其呼吸控制比率明顯下降。這些結(jié)果表明自花花粉管線粒體功能發(fā)生紊亂。采用二維電泳對自花花粉管線粒體可溶性蛋白進行了分析，自花花粉管線粒體與異花花粉管線粒體可溶性蛋白共匹配了70個蛋白點，具有顯著性差異的蛋白點為18個，其中上調(diào)的為7個，下調(diào)的為11個。
　　2.明確了離體梨花粉從萌發(fā)到生長停止，這一發(fā)育過程屬于植物器官衰老。揭示了梨花粉管生長發(fā)育過程涉及衰老并最終死亡過程由

3、胞質(zhì)酸化誘導(dǎo)的線粒體功能紊亂介導(dǎo)。梨花粉水合后0～9h，花粉管維持較高生長速率，到15h后，生長基本停止。FDA染色顯示停止生長的花粉管已失去活力。以植物衰老的生理及細胞學(xué)指標(biāo)對停止生長的梨花粉管進行分析，結(jié)果顯示，衰老的花粉管丙二醛含量和電解質(zhì)滲漏率明顯升高。在細胞水平上，觀測到衰老的梨花粉管內(nèi)微絲骨架大量解聚，細胞核DNA降解。在衰老的梨花粉管中，V-ATPase活性降低導(dǎo)致胞質(zhì)酸化。胞質(zhì)酸化可以直接誘導(dǎo)線粒體功能衰退，其中包括線粒

4、體內(nèi)部脊結(jié)構(gòu)紊亂、溶脹，呼吸氧消耗及ATP產(chǎn)生下降，膜電位下降等。此外，用線粒體膜電位去極化試劑纈氨霉素處理花粉管，使線粒體功能衰退，從而誘導(dǎo)了花粉管細胞核降解。該藥理學(xué)實驗進一步證實了線粒體功能受到破壞可以導(dǎo)致花粉管細胞核降解。
　　3.明確了梨花粉管尖端活性氧主要來源為質(zhì)膜NADPH氧化酶。結(jié)果表明，NaN3處理顯著抑制了梨花粉管線粒體呼吸功能，但是線粒體呼吸功能的失調(diào)并不能完全消除花粉管尖端活性氧，這說明線粒體可能不是花粉管

5、尖端活性氧的主要貢獻者。但是，NADPH氧化酶抑制劑DPI基本能清除尖端活性氧，此外，發(fā)現(xiàn)低溫處理誘導(dǎo)了花粉管尖端活性氧顯著下降。同時深入研究，成功克隆了梨花粉管NADPH氧化酶基因（PrRBOH）全長，其編碼氨基酸序列具有植物RBOHs家族蛋白功能域。熒光定量PCR分析結(jié)果顯示，低溫處理后，花粉管內(nèi)PrRBOH呈現(xiàn)低表達量。這些結(jié)果說明，梨花粉管尖端ROS主要調(diào)控因子是NADPH氧化酶。
　　4.探明了低溫通過抑制線粒體能量代謝

6、功能，從而調(diào)控花粉管胞吞作用，最終抑制梨花粉管生長的過程。在低溫條件下，花粉管生長通常被抑制。在花粉管快速生長過程中，需要線粒體產(chǎn)生足夠的能量以滿足胞內(nèi)各種代謝活動需求。其中，花粉管伸長所需要的細胞壁合成物質(zhì)通常經(jīng)囊泡運輸?shù)揭欢ㄎ恢?，這一過程需要大量ATP。本章研究從線粒體能量代謝角度深入探討了其在低溫條件下調(diào)控梨花粉管生長特點。結(jié)果顯示，4℃低溫完全抑制了梨花粉管生長。進一步分析發(fā)現(xiàn)，低溫導(dǎo)致了花粉管尖端胞吞作用停止，線粒體呼吸作用降