梨花粉管細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)變化的調(diào)控研究.pdf

1、細(xì)胞骨架在植物細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起著重要的作用。本研究利用砂梨品種‘豐水’和‘今村秋’的花粉和花柱為試材，研究了細(xì)胞骨架在梨花粉管生長(zhǎng)發(fā)育以及脅迫過(guò)程中的作用，主要結(jié)果如下:
　　1.研究了各類(lèi)細(xì)胞信號(hào)分子與梨花粉管細(xì)胞骨架的互作情況。觀察到花粉管內(nèi)微管骨架的結(jié)構(gòu)，通過(guò)藥劑學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)微管參與了花粉管的生長(zhǎng)過(guò)程;鈣離子載體A23187處理0.5h后尖端微絲環(huán)狀結(jié)構(gòu)消失，微管解聚，處理1h后尖端與亞尖端微絲解聚;EGTA處理則會(huì)使微

2、絲骨架解聚而對(duì)微管骨架影響較小;鈣調(diào)素抗血清處理能夠?qū)е挛⒔z骨架解聚，表明花粉管內(nèi)鈣離子的變化能夠調(diào)控細(xì)胞骨架的結(jié)構(gòu)改變;ROS的變化顯著影響細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的變化，而NO的變化對(duì)細(xì)胞骨架變化的影響較小;同時(shí)發(fā)現(xiàn)微管骨架結(jié)構(gòu)變化能夠影響花粉管內(nèi)鈣離子的振蕩與分布，也能影響花粉管內(nèi)NO和ROS的分布與濃度。
　　2.研究了細(xì)胞骨架的變化對(duì)于梨花粉管中細(xì)胞核降解與線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)的影響。微管骨架解聚劑Oryzalin處理2h后細(xì)胞核降解，間接表

3、明微管骨架解聚是花粉管生長(zhǎng)停止信號(hào)途徑中早期的信號(hào)因子;細(xì)胞骨架的解聚會(huì)造成線(xiàn)粒體膜電勢(shì)降低，從而向細(xì)胞質(zhì)中釋放出細(xì)胞色素C，促進(jìn)了細(xì)胞核的降解，加速了PCD過(guò)程;而細(xì)胞骨架的穩(wěn)定則會(huì)緩解自交不親和反應(yīng)中花粉管的PCD過(guò)程;利用透射電鏡技術(shù)研究了細(xì)胞骨架變化對(duì)梨自交不親和過(guò)程中花粉管線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)的影響，微管解聚后花粉管內(nèi)線(xiàn)粒體體積沒(méi)有顯著變化，但內(nèi)部分脊結(jié)構(gòu)消失，膜變厚;而微管骨架穩(wěn)定劑與不親和花柱S-RNase協(xié)同處理后能夠顯著穩(wěn)定不親

4、和花柱S-RNase對(duì)線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)的破壞作用，只有部分線(xiàn)粒體內(nèi)脊結(jié)構(gòu)消失，線(xiàn)粒體體積與對(duì)照沒(méi)有顯著變化;微絲解聚后線(xiàn)粒體體積增大，部分線(xiàn)粒體內(nèi)脊被破壞;微絲穩(wěn)定劑對(duì)不親和花柱S-RNase對(duì)線(xiàn)粒體破壞的恢復(fù)作用效果不明顯，協(xié)同處理后花粉管內(nèi)線(xiàn)粒體仍然膨大，不具有脊結(jié)構(gòu)。上述結(jié)果表明微管的穩(wěn)定能夠緩解不親和花柱S-RNase對(duì)線(xiàn)粒體的破壞，而微絲的穩(wěn)定則對(duì)不親和花柱S-RNase對(duì)線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)的破壞的穩(wěn)定作用不顯著。
　　3.基于梨基因

5、組的生物信息學(xué)分析獲得了梨微絲與微管相關(guān)蛋白基因。通過(guò)比對(duì)查找到15個(gè)推測(cè)為Myosin家族的基因，利用系統(tǒng)發(fā)育分析將其分為7組，并發(fā)現(xiàn)這些Myosin基因在梨染色體中均勻分布;基因結(jié)構(gòu)域分析表明，梨中MyosinⅧ大類(lèi)基因缺少了SH3和DIL結(jié)構(gòu)域;在梨基因組中比對(duì)到11個(gè)推測(cè)為MAP65家族的基因，利用系統(tǒng)發(fā)育分析將其分為4組，根據(jù)同源性比對(duì)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)每組中的梨MAP65基因與同組的擬南芥MAP65基因具有高度的同源性。
　　

6、4.研究了梨花柱S-RNase與游離氨基酸對(duì)花粉管生長(zhǎng)及其細(xì)胞骨架的作用。微管穩(wěn)定劑紫杉醇與花柱S-RNase同時(shí)處理顯示:微管的穩(wěn)定能夠緩解花柱S-RNase對(duì)不親和花粉管生長(zhǎng)長(zhǎng)度的抑制作用，而對(duì)于S-RNase對(duì)萌發(fā)率的抑制作用沒(méi)有顯著影響;不親和花柱S-RNase能夠使花粉管內(nèi)皮層微管快速消失，含有GC的花粉管比率顯著下降，親和花柱S-RNase處理后花粉管內(nèi)微管骨架沒(méi)有顯著變化;紫杉醇和不親和花柱S-RNase同時(shí)處理能夠緩解不

7、親和S-RNase對(duì)花粉管微管的解聚作用。同時(shí)發(fā)現(xiàn)鈣離子調(diào)控蛋白鈣調(diào)素能夠穩(wěn)定不親和S-RNase引起的微絲降解;微管穩(wěn)定劑紫杉醇能夠緩解不親和S-RNase引起的鈣離子振幅提高、鈣梯度下降;NO的清除劑c-PTIO能夠穩(wěn)定不親和S-RNase引起的微絲與微管骨架的解聚;而微管穩(wěn)定劑也能夠緩解不親和S-RNase引起的ROS下降。上述結(jié)果表明:微管參與了梨自交不親和過(guò)程;并發(fā)現(xiàn)梨自交不親和過(guò)程中花粉管內(nèi)細(xì)胞骨架與鈣離子以及NO/ROS系

8、統(tǒng)存在相互作用。
　　梨花柱中測(cè)定出了14種游離氨基酸，其中谷氨酸含量最高;利用這些種類(lèi)氨基酸的L型、D型對(duì)花粉管生長(zhǎng)的研究發(fā)現(xiàn)，其中8中氨基酸對(duì)梨花粉管生長(zhǎng)存在濃度依賴(lài)型:L-、D-谷氨酸，L-、D-半胱氨酸，L-、D-苯丙氨酸，D-纈氨酸和L-天冬氨酸;使用上述高濃度氨基酸處理后微絲骨架結(jié)構(gòu)變化顯示:高濃度的D-纈氨酸、D-苯丙氨酸和L-半胱氨酸能夠使花粉管內(nèi)微絲骨架解聚，出現(xiàn)片段化;L-苯丙氨酸處理后尖端出現(xiàn)微絲結(jié)構(gòu)，花粉管

9、內(nèi)微絲增粗;L-天冬氨酸、D-谷氨酸和D-半胱氨酸處理后尖端微絲骨架環(huán)狀結(jié)構(gòu)消失，且亞尖端微絲消失;而L-谷氨酸處理后微絲結(jié)構(gòu)沒(méi)有顯著的變化。
　　5.研究了各種外源因素（生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑與多胺、膨壓變化、金屬離子、溫度變化等）對(duì)花粉管內(nèi)細(xì)胞骨架的影響。生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)于花粉管生長(zhǎng)與微絲骨架的影響表明，GA3和玉米素對(duì)于花粉管生長(zhǎng)的調(diào)控具有濃度依賴(lài)性，低濃度的促進(jìn)生長(zhǎng)，而高濃度則抑制生長(zhǎng)并使花粉管內(nèi)細(xì)胞骨架?chē)?yán)重解聚;低濃度的ABA促進(jìn)花粉管

10、生長(zhǎng)，使花粉管尖端微絲骨架的環(huán)狀結(jié)構(gòu)消失;低濃度精胺(0.1mM)對(duì)梨花粉管內(nèi)微絲骨架結(jié)構(gòu)沒(méi)有顯著的影響，而高濃度的精胺與亞精胺(0.5mM)都都能夠使花粉管內(nèi)微絲骨架解聚，但精胺處理的反應(yīng)更顯著。
　　研究測(cè)定了梨花粉管中的滲透壓為0.6M，低滲處理后花粉管尖端膨大，尖端微絲結(jié)構(gòu)扭曲，高滲處理后出現(xiàn)微絲扭曲的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，尖端微絲缺失;梨花粉管對(duì)Cu2+較敏感，抑制濃度為5μM，而Al3+和Na+的抑制濃度分別為2mM和50mM，C