擬南芥AtFIM4和AtFIM5對花粉萌發(fā)和花粉管極性生長調(diào)控機(jī)理的研究.pdf

1、花粉萌發(fā)和花粉管生長是開花植物進(jìn)行有性生殖所必需的生理活動，微絲骨架在這個(gè)過程中起著決定性的作用?；ǚ酃茏鳛橹参镏械湫偷臉O性生長細(xì)胞，其中的微絲骨架被廣泛研究。微絲束對極性細(xì)胞的生長至關(guān)重要。微絲成束的過程受多種肌動蛋白結(jié)合蛋白(actin-binding proteins，ABPs)的調(diào)控。
　　Fimbrins，也被稱為plastins，是目前為止植物中鑒定出來的唯一一種含有CH-domain的肌動蛋白結(jié)合蛋白。擬南芥中共有5

2、個(gè)家族成員，命名為AtFIM1-5。已有研究表明AtFIM4和AtFIM5在極性細(xì)胞花粉管中大量表達(dá)，且均能使單體肌動蛋白組裝成更加高級的結(jié)構(gòu)，但二者的具體調(diào)控機(jī)制和功能聯(lián)系尚不清楚。因此，鑒定和研究擬南芥中AtFIM4和AtFIM5對花粉萌發(fā)和花粉管生長的調(diào)控機(jī)理對于揭示植物微絲骨架的調(diào)節(jié)機(jī)制具有非常重要的意義，同時(shí)也有助于了解微絲骨架在植物有性生殖中的關(guān)鍵作用。在本研究中，我們從生理和體外生化兩個(gè)方面研究了肌動蛋白結(jié)合蛋白AtFIM

3、4和AtFIM5對擬南芥極性細(xì)胞花粉管的調(diào)節(jié)功能，并對二者的功能聯(lián)系和分工進(jìn)行了初步的探索。取得的主要研究成果如下:
　　1.生物信息學(xué)分析表明AtFIM4和AtFIM5具有較高同源性，且表達(dá)譜有重疊現(xiàn)象，但在系統(tǒng)進(jìn)化樹中分屬不同的枝干，推測二者在保留家族保守性的同時(shí)進(jìn)化出了不同的功能;
　　2.與野生型相比，T-DNA插入單突變體表型無顯著差異，而雙突變體則差異顯著，主要表現(xiàn)為:花粉萌發(fā)率降低、花粉管生長受到抑制、出現(xiàn)較高

4、的畸形比率、莢果變短、且花粉管中肌動蛋白束明顯減少。說明AtFIM4和AtFIM5對花粉管內(nèi)微絲骨架的結(jié)構(gòu)維持至關(guān)重要，二者功能缺失會對花粉管的生長產(chǎn)生抑制作用;
　　3.GUS組織化學(xué)活性檢測分析結(jié)果清楚顯示了AtFIM4和AtFIM5在花粉管中的表達(dá)情況:AtFIM4在花粉萌發(fā)后開始表達(dá)，而AtFIM5在花粉粒和花粉管生長階段均有表達(dá);
　　4.體外生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明與AtFIM5相比，AtFIM4結(jié)合肌動蛋白并使之成束的

5、能力更強(qiáng)，而且AtFIM4和AtFIM5均能抑制微絲解聚藥物L(fēng)at B對微絲的解聚;同時(shí)，激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果表明AtFIM4與AtFIM5都能體外結(jié)合微絲，AtFIM4使微絲形成疏松的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而AtFIM5使微絲形成致密的帶狀結(jié)構(gòu);
　　5.為了探索AtFIM5蛋白序列中對微絲成束功能起關(guān)鍵性作用的位點(diǎn)，我們構(gòu)建了單位點(diǎn)突變蛋白AtFIM5-461和雙位點(diǎn)突變蛋白AtFIM5-589，并進(jìn)行了一系列體外生化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明A

6、tFIM5-461并不影響AtFIM5結(jié)合微絲的能力，AtFIM5-589則在一定程度上增強(qiáng)了AtFIM5結(jié)合微絲的能力;此外，AtFIM5-461和AtFIM5-589不影響AtFIM5組裝微絲的方式。
　　綜上所述，本研究運(yùn)用了分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)及體外生化等方法對AtFIM4和AtFIM5在花粉萌發(fā)和花粉管生長中的調(diào)控功能進(jìn)行了探索，我們的研究表明AtFIM4和AtFIM5這兩種肌動蛋白結(jié)合蛋白在花粉管中微絲束的形成中發(fā)揮