標記基因誘導剪切和潔凈DNA轉(zhuǎn)化培育安全轉(zhuǎn)基因水稻植株.pdf

1、轉(zhuǎn)基因植物中存在的抗性選擇標記基因和質(zhì)粒載體框架序列是目前公認的兩個主要導致轉(zhuǎn)基因植物安全性問題的根源。Cre/LoxP誘導剪切系統(tǒng)是剔除標記基因的有效系統(tǒng)。本文以nptⅡ為抗性標記基因，報告基因gusA為目的基因，采用雌激素誘導型Cre/loxP標記基因剪切系統(tǒng)載體pNCG，研究在轉(zhuǎn)化細胞水平上刪除轉(zhuǎn)基因水稻中抗性標記基因的可行性和效率，并采用潔凈DNA轉(zhuǎn)化技術(shù)將包含雌激素誘導Cre/loxP標記基因剪切系統(tǒng)和gusA表達框的DNA片

2、段(DNA fragment carrying estrogen-induced Cre/LoxP marker gene excision system and gusA gene expression cassette, F-Cre/LoxP-gusA)通過基因槍導入水稻，研究了潔凈DNA轉(zhuǎn)化和標記基因誘導剪切系統(tǒng)結(jié)合獲得安全轉(zhuǎn)基因水稻植株的可行性。主要結(jié)果如下：
　　 1農(nóng)桿菌介導pNCG質(zhì)粒轉(zhuǎn)化水稻成熟胚愈傷組織，經(jīng)G4

3、18篩選獲得抗性愈傷組織后，在抗性愈傷組織培養(yǎng)的預分化前、預分化和分化階段添加25μmol.L-1雌激素誘導表達重組酶Cre均能成功切除標記基因序列，標記基因剪切成功率在6.82～46.43％之間。在預分化前采用液體培養(yǎng)基添加雌激素誘導處理愈傷組織3d，T0代轉(zhuǎn)基因植株中標記基因的剪切效率最高(173.33％)，主要原因是雌激素處理提高了愈傷組織綠苗分化率；直接在分化培養(yǎng)基中添加雌激素誘導處理，T0代轉(zhuǎn)基因植株中標記基因剪切成功率達46

4、.43％，剪切效率(144.44％)也較高。表明應用Cre/loxP系統(tǒng)在水稻抗性愈傷組織水平上進行雌激素誘導處理能夠?qū)D(zhuǎn)基因植株標記基因?qū)崿F(xiàn)高效快速刪除。對T0代剪切成功與失敗的轉(zhuǎn)基因植株基因組gusA基因的southern雜交分析說明，剪切成功的轉(zhuǎn)基因植株在水稻基因組中均以單拷貝模式整合，而剪切失敗的則出現(xiàn)雙拷貝整合模式。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化模式相對比較簡單，雜交結(jié)果與實驗預期相同。該體系的建立論證了細胞水平上的誘導剪切是有效可行的，也是是本

5、研究的創(chuàng)新點之一。
　　 2采用潔凈DNA轉(zhuǎn)化技術(shù)將F-Cre/LoxP-gus A DNA片段由基因槍介導轉(zhuǎn)化水稻幼胚愈傷組織，經(jīng)G418篩選兩輪得到抗性愈傷后，在抗性愈傷組織培養(yǎng)的不同階段添加25μmol.L-1雌激素誘導表達重組酶Cre進行標記基因剪切處理，處理方式包括：預分化前(BS)、預分化中(PS)、分化中(DS)及聯(lián)合處理中的BS+PS，BS+DS，PS+DS以及BS+PS+DS共7種處理方式。結(jié)果表明：處理組PS

6、、DS、PS+DS和BS+PS+DS四個處理組獲得了86株標記基因剪切成功的轉(zhuǎn)基因水稻植株，而BS、BS+PS及BS+DS三個處理組并未得到成功切除標記基因序列的水稻植株。具體結(jié)果如下：
　　 (1)PS處理組標記基因剪切成功率最高，達到32％，DS處理組的剪切成功率為25.84％，但是DS組愈傷分化率(24.19)比PS處理組(1.56)顯著增高，達到PS處理組15.48倍，PS+DS聯(lián)合處理組標記基因剪切成功率只有4.97％

7、，比PS或DS單一處理時都要低，且PS+DS聯(lián)合處理后愈傷分化率為11.31介于1.56與24.19之間，相比PS單一處理大大提高了愈傷組織的分化，但卻比DS單一處理分化率降低了一倍。可見雌激素誘導處理對愈傷分化率有很大的影響，預分化階段添加雌激素進行誘導處理時，愈傷組織分化受到明顯的抑制，而分化中的雌激素處理則可以促進愈傷組織細胞的分化再生。實驗共轟擊133塊愈傷，得到13組抗性愈傷克隆，雌激素誘導處理后愈傷組織分化再生664株綠苗，

8、其中86株為不含任何垃圾DNA而只含目的基因gusA表達框的安全轉(zhuǎn)基因水稻植株，而且Southern雜交分析表明獲得的T0代無標記基因的轉(zhuǎn)基因水稻植株中g(shù)usA基因為單拷貝整合。研究利用潔凈DNA轉(zhuǎn)化技術(shù)將標記基因誘導剪切系統(tǒng)線性DNA片段導入水稻細胞，并結(jié)合細胞水平上標記基因的誘導切除培育了安全轉(zhuǎn)基因水稻植株，這是本研究的創(chuàng)新點之二。
　　 (2)經(jīng)過細胞水平上雌激素誘導處理而獲得的T0代無標記基因的轉(zhuǎn)基因水稻植株農(nóng)藝性狀存在