人類甜味受體蛋白T1R2-T1R3胞外端的真核表達(dá)、純化和鑒定.pdf

1、味覺是動(dòng)物攝食行為的決定性因素，甜味作為味覺中最神秘的基本味覺形式，賦予動(dòng)物食物營(yíng)養(yǎng)信息。近幾十年來甜味受體的發(fā)現(xiàn)及其功能的確定，為人類食品的開發(fā)、生產(chǎn)及人類健康提供了大量理論基礎(chǔ)。但甜味識(shí)別機(jī)制的深入探索受到了甜味受體晶體結(jié)構(gòu)缺失的嚴(yán)重限制。所以本研究在實(shí)驗(yàn)室前期研究基礎(chǔ)之上，以帶有人類甜味受體T1R2和T1R3基因的pcDNA3.1重組質(zhì)粒為對(duì)象亞克隆了人類甜味受體基因胞外端，以此為基礎(chǔ)構(gòu)建甜味受體胞外端的真核表達(dá)載體pIRES-T

2、1R2-T1R3，脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染外源表達(dá)載體HEK293SGnTI-細(xì)胞，獲得高效表達(dá)的人類甜味受體胞外端蛋白，并對(duì)其進(jìn)行純化和表達(dá)鑒定，以期在甜味識(shí)別的熱力學(xué)及甜味受體結(jié)構(gòu)等研究中獲得更多信息。
　　 研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下:
　　 (1)含有甜味受體胞外端基因的真核表達(dá)載體的構(gòu)建
　　 根據(jù)NCBI基因庫中人類甜味受體基因T1R2/T1R3胞外段序列設(shè)計(jì)出特異性引物，以含全長(zhǎng)hT1R2和hT1R3基因的pcDNA

3、TM3.1/Zeo(+)和pcDNATM3.1/Zeo(-)質(zhì)粒為模板，通過RT-PCR擴(kuò)增獲得了目的基因，將其回收、純化經(jīng)酶切后與克隆載體pIRES連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在含氨芐青霉素的LB平板上篩選出陽性克隆質(zhì)粒，挑取陽性克隆進(jìn)行擴(kuò)培，抽提后凝膠電泳驗(yàn)證其大小為9，000bp左右，與理論大小相一致;基因測(cè)序結(jié)果與NCBI中甜味受體胞外端基因比對(duì)匹配吻合，表明成功的構(gòu)建了pIRES-T1R2-T1R3重組質(zhì)粒。
　　

4、(2)甜味受體蛋白表達(dá)及純化
　　 利用293-FreeTMTransfectionReagent試劑將重組質(zhì)粒pIRES-T1R2-T1R3轉(zhuǎn)染到覆蓋率為60％～70％的HEK293SGnTI-細(xì)胞，收集轉(zhuǎn)染48h后的HEK293SGnTI-細(xì)胞，提取總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，目的蛋白成功表達(dá)，其條帶大小為50kDa左右;Ni柱樹脂對(duì)粗蛋白進(jìn)行純化，蛋白質(zhì)電泳檢測(cè)顯示目的蛋白條帶單一，表明純化成功，測(cè)得其濃度為0.845

5、mg/mL。
　　 (3)表達(dá)結(jié)果的鑒定
　　 分別采用免疫組織化學(xué)、等溫量熱滴定(ITC)、質(zhì)譜和N-端測(cè)序的方法，對(duì)表達(dá)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。細(xì)胞免疫結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染細(xì)胞與陽性對(duì)照組表達(dá)有甜味受體蛋白的人結(jié)腸癌細(xì)胞NCI-H716免疫效果一致，細(xì)胞膜上呈綠色熒光，表明重組質(zhì)粒pIRES-T1R2-T1R3成功在HEK293SGnTI-細(xì)胞中表達(dá)，功能與天然的甜味受體幾乎一致;與甜味劑葡萄糖的ITC滴定結(jié)果顯示，試驗(yàn)組重組蛋白與

6、對(duì)照組NCI-H716細(xì)胞一樣都是放熱的過程，但重組蛋白與葡萄糖的滴定曲線趨勢(shì)變化顯著，避免了眾多因素的影響逐漸達(dá)到平衡，表明目的蛋白可以取代細(xì)胞作為甜味識(shí)別熱力學(xué)研究的受體原料;N-端測(cè)序結(jié)果顯示無氨基酸峰出現(xiàn)，表明目的蛋白N端封閉，所以無法利用Edman降解獲得N-端氨基酸序列的信息;重組蛋白質(zhì)譜結(jié)果顯示:其分子量大小為50，529Da，與SDS-PAGE檢測(cè)的50kDa結(jié)果一致;重組蛋白等電點(diǎn)為5.52，序列覆蓋率為12％，通過蛋

7、白數(shù)據(jù)庫檢索得到與其匹配的肽段分別是:SNMNMFESYINNLR，LEGLTDEINFLRQLYEEEIR，ASLEAIADAEQR和LALDIEIATYR，匹配的蛋白為人源甜味受體T1R2/T1T3，說明成功表達(dá)純化出目的蛋白。
　　 總之，本文在前期研究的基礎(chǔ)上，采用多種實(shí)驗(yàn)手段，成功的構(gòu)建了含甜味受體胞外端的真核表達(dá)載體，脂質(zhì)體介導(dǎo)其在HEK293SGnTI-細(xì)胞中表達(dá)，Ni柱樹脂純化，并進(jìn)一步通過免疫組化、ITC、質(zhì)譜