Hsa-miR-125a-5p調(diào)控Rab25-PI3K-AKT通路在NSCLC-TKIs耐藥中的作用研究.pdf

1、目的：
　　耐藥是影響EGFR-TKIs臨床療效的主要因素之一。本課題擬在誘導厄洛替尼耐藥細胞基礎上，通過一系列實驗探討miR-125a通過Rab25參與NSCLC EGFR-TKIs獲得性耐藥的相關機制。
　　方法：
　　1．miR-125a-5p、Rab25在肺腺癌中表達與TKIs耐藥的關系：通過PCR檢測3對親本株及對應的耐厄洛替尼細胞株（A549/A549ER，PC9/PC9ER，HCC827/HCC827ER

2、）中miR-125a-5p、Rab25的表達，分析其相關性。
　　2．Hsa-miR-125a-5p與Rab25靶向調(diào)控關系驗證：通過生物信息學軟件預測miR-125a-5p與Rab253’-UTR結合區(qū)域，構建Rab253’-UTR-WT及對應的突變載體Rab253’-UTR-MU、miR-125a-5p過表真核載體，使用雙熒光素酶報告基因檢測miR-125a-5p與Rab253'UTR區(qū)的結合情況。
　　3．miR-12

3、5a-5p及Rab25在TKIs獲得性耐藥的機制：分別構建靶向干擾Rab25基因的慢病毒載體及過表達miR-125a的慢病毒載體，經(jīng)病毒包裝、濃縮后感染PC9ER，采用CCK-8法檢測耐藥性變化，流式細胞儀檢測細胞凋亡及細胞周期變化，qRT-PCR和western-blot檢測Rab25、Akt、Caspase-3、PARP、EGFR、Bcl-2、BAX mRNA及蛋白的表達。
　　結果：
　　1．miR-125a-5p在T

4、KI耐藥株中呈低表達、Rab25在TKI耐藥株中呈高表達，且兩者均與TKI耐藥顯著性相關。
　　2．生物信息學顯示，miR-125a-5p與Rab25有相關作用的區(qū)域，位于Rab253’UTR區(qū)的120-126nt。成功構建Rab25基因3’-UTR雙熒光素酶報告基因載體及其突變型載體,miR-125a過表達真核載體。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烇@示組4（Rab253' UTR+miR-125a-5p）與組2（Rab253' UTR+m

5、iRNA-NC）比較熒光素酶活性顯著下降，P=0.0489，差異具有顯著性；組6（Rab253' UTR-MU+miR-125a-5p）與組4（Rab253'UTR+miR-125a-5p）比較熒光素酶活性顯著升高，P<0.0001，差異具有顯著性；其余各組熒光素酶活性表達均無顯著差異。上述結果證實Rab25基因miR-125a-5p直接作用的靶基因，且miR-125a-5p結合于Rab25基因的3’-UTR區(qū)域，在轉(zhuǎn)錄后水平對Rab2

6、5基因有直接抑制作用。
　　3．成功構建并鑒定干擾Rab25及過表達miR-125a-5p的慢病毒表達載體。CCK-8實驗發(fā)現(xiàn)干擾Rab25及過表達miR-125a-5p能降低厄洛替尼對PC9ER細胞耐藥指數(shù)，發(fā)揮逆轉(zhuǎn)耐藥的作用。流式分析發(fā)現(xiàn)干擾Rab25及過表達miR-125a-5p能增加厄洛替尼介導的PC9ER細胞凋亡及G0/G1期細胞阻滯。Real-Time RT-PCR及WB發(fā)現(xiàn)干擾Rab25及過表達miR-125a-5p

7、均能使PC9/ER細胞內(nèi)的Rab25、Bcl-2、PARP及Akt mRNA和蛋白的表達下調(diào)，尤其以AKT的磷酸化水平下調(diào)明顯，能夠增加BAX的mRNA及蛋白表達水平，增加C-PARP的蛋白表達水平。
　　結論：
　　1. miR-125a-5p及Rab25在肺腺癌中均呈差異性表達，與TKI耐藥顯著性相關。
　　2. Rab25基因是has-miR-125a-5p直接作用的靶基因，且miR-125a-5p結合于Rab2