轉(zhuǎn)錄抑制因子ZHX2對(duì)SCAPs增殖及成骨-成牙本質(zhì)向分化的作用研究.pdf

1、目的：
　　根尖乳頭干細(xì)胞(stem cells from the apical papilla，SCAPs)，位于未發(fā)育完成的年輕恒牙的根尖部，是取于正在發(fā)育組織的一種成體間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)。SCAPs有多向分化潛能，與牙髓干細(xì)胞相比，SCAPs具有更強(qiáng)的增殖與分化潛能，在牙根發(fā)育過程中，SCAPs可以分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞和形成根部的牙本質(zhì)，然而，涉及調(diào)控SCAPs分化的細(xì)胞因子

2、還未闡明清楚。鋅指結(jié)構(gòu)同源結(jié)構(gòu)域2(Zinc fingers and homeoboxes2，ZHX2)是一種新的轉(zhuǎn)錄抑制因子。ZHX2mRNA在多種組織中廣泛表達(dá)，有報(bào)道顯示ZHX2參與調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞、肝細(xì)胞、B細(xì)胞和紅系細(xì)胞等的發(fā)育。但是關(guān)于ZHX2對(duì)牙根發(fā)育的作用還不清楚。牙齒的發(fā)育形成是由一系列信號(hào)分子共同調(diào)節(jié)，在此過程中，ZHX2是否參與其中呢？在本實(shí)驗(yàn)中，我們主要探討ZHX2對(duì)SCAPs增殖及成骨/成牙本質(zhì)向分化的作用。

3、>　　方法與結(jié)果：
　　1.根尖乳頭干細(xì)胞的分離，培養(yǎng)及鑒定
　　酶消化法分離培養(yǎng)人根尖乳頭干細(xì)胞，分別礦化誘導(dǎo)兩周和成脂誘導(dǎo)四周，觀察SCPAs的成骨和成脂分化潛能，顯微鏡下觀察茜素紅和油紅O染色，結(jié)果顯示有大量礦化結(jié)節(jié)和脂滴的形成;細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)到STRO-1在SCAPs中有明顯的高表達(dá);流式細(xì)胞儀分析根尖乳頭干細(xì)胞的表面標(biāo)記分子，結(jié)果顯示SCAPs陽性表達(dá)CD146和CD24，對(duì)上皮細(xì)胞源性的CD45則呈陰性表達(dá)。

4、
　　2.ZHX2在SCAPs中的內(nèi)源性表達(dá)以及ZHX2與成骨/成牙本質(zhì)向分化的相關(guān)性
　　SCAPs在常規(guī)培養(yǎng)基下培養(yǎng)，RT-PCR檢測(cè)ZHX2在SCAPs中的內(nèi)源性表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SCAPs中有顯著的ZHX2的表達(dá);礦化誘導(dǎo)不同時(shí)間點(diǎn)，qRT-PCR和Western Blotting共同檢測(cè)ZHX2與成骨/成牙本質(zhì)向分化的相關(guān)性，結(jié)果顯示在一定誘導(dǎo)時(shí)間段內(nèi)，ZHX2的表達(dá)隨礦化時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，提示ZHX2與細(xì)胞礦化呈正相

5、關(guān)關(guān)系，與成骨/成牙本質(zhì)向分化有密切關(guān)聯(lián)。
　　3.ZHX2對(duì)SCAPs增殖及成骨/成牙本質(zhì)向分化的影響
　　過表達(dá)或干擾ZHX2后常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞，CCK8法檢測(cè)ZHX2對(duì)SCAPs增殖的影響，結(jié)果顯示ZHX2對(duì)SCAPs的增殖有明顯抑制作用。
　　過表達(dá)ZHX2后礦化誘導(dǎo)一周，qRT-PCR和Western Blotting分別檢測(cè)牙本質(zhì)特異性標(biāo)記物牙本質(zhì)涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein，

6、DSPP)以及成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(runt-related transcription factor2，RUNX2)、骨涎蛋白(bonesialoprotein，BSP)、骨鈣素(osteocalcin，OCN) mRNA和蛋白水平的表達(dá)。結(jié)果顯示過表達(dá)ZHX2后DSPP、RUNX2、BSP、OCN mRNA和蛋白水平均上升。同時(shí)，檢測(cè)堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)的活性，結(jié)果表明ZHX2過表達(dá)后SCAPs

7、的ALP活性明顯升高。
　　慢病毒干擾ZHX2后礦化誘導(dǎo)3天和5天，檢測(cè)ALP活性;誘導(dǎo)一周后，qRT-PCR和Western Blotting分別檢測(cè)礦化相關(guān)基因(DSPP、Runx2、BSP、OCN)的表達(dá)變化;誘導(dǎo)兩周后，茜素紅染色觀察礦化結(jié)節(jié)的形成以及進(jìn)行鈣離子的半定量檢測(cè)。結(jié)果顯示干擾ZHX2后，ALP活性下降，DSPP、RUNX2、BSP、OCN mRNA和蛋白水平明顯降低，與對(duì)照組相比礦化結(jié)節(jié)數(shù)量減少，相應(yīng)的干擾組鈣