新型轉錄因子ZHX2抑制AFP表達功能片段的尋找及其對細胞生長作用的研究.pdf

1、研究目的： 尋找新型轉錄因子ZHX2抑制AFP表達的功能片段，并探討其對肝癌細胞生長的影響，為闡明ZHX2的結構與功能奠定基礎，同時也為探索新的肝癌基因治療方法提供幫助。 研究方法： 一、新型轉錄因子ZHX2抑制AFP表達功能片段的尋找 1、新型轉錄抑制因子ZHX2不同截短片段的克隆表達 ①融合表達載體p1ZHX2（1-501AA）-HA，p2ZHX2（242-338AA）-HA，p3ZHX2（2

2、42-501AA）-HA的構建 根據(jù)PubMed中人ZHX2 cDNA序列（gi：63079684），利用Primer Premier5．0軟件，設計擴增不同長度ZHX2片段的特異性引物，為便于克隆和表達，上下游引物分別包含KpnI、EcoRI酶切位點，并在下游引物引入HA-tag序列。以pcDNA-ZHX2-HA的cDNA為模板，PCR擴增人ZHX2基因兩個鋅指結構域（zinc finger domains）和前兩個同源結構域

3、（homoboxes，HD1，HD2），即1-501AA片段、242-338AA片段、242-501AA片段。PCR產物分別經KpnI，EcoRI雙酶切，回收后分別克隆入pcDNA3．0載體。連接產物轉化大腸桿菌JM109，LA平板篩選挑取陽性重組子，并經酶切、DNA測序分析鑒定，分別命名為p1ZHX2（1-501AA）-HA，p2ZHX2（242-338AA）-HA， p3ZHX2（242-501AA）-HA。 ②Wester

4、n blot檢測ZHX2不同截短片段在細胞中的表達 p1ZHX2（1-501AA）-HA，p2ZHX2（242-338AA）-HA， p3ZHX2（242-501AA）-HA脂質體法轉染肝癌細胞HepG2、HepG2．2．15及非洲綠猴腎細胞COS-7，48h后收集細胞，提取總蛋白，以HA單抗作為一抗，HRP標記的抗鼠抗體為二抗，western blot分析ZHX2不同截短片段蛋白的表達情況。 2、ZHX2不同截短片段

5、蛋白對肝癌細胞系AFP的抑制作用 ①肝癌細胞系HepG2、HepG2．2．15中過量表達ZHX2不同截短片段對AFP的影響 ZHX2不同截短片段的質粒p1ZHX2（1-501AA）-HA，p2ZHX2（242-338AA）-HA，p3ZHX2（242-501AA）-HA分別轉染肝癌細胞系HepG2、HepG2．2．15細胞，48h后收集細胞及培養(yǎng)上清，ELISA檢測培養(yǎng)上清中AFP的表達，同時western blot檢

6、測細胞中不同截短片段融合蛋白的表達。 ②ZHX2不同截短片段蛋白對AFP核心啟動子的抑制作用 ZHX2不同截短片段的重組質粒各0．3μg分別與0．6μg AFP核心啟動子報告質粒（phAF269）DNA共轉染HepG2和HepG2．2．15細胞（各孔以pCDNA3．0 DNA將質粒補足至1μg），同時每孔轉染20ng的pRL-TK，做為轉染率內參照。轉染48h后，收集細胞，進行雙熒光素酶分析。 ③雙熒光素酶報告

7、基因檢測 按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書將細胞裂解后與底物混合，用熒光計數(shù)儀檢測熒光強度M1與熒光強度M2。以M1與M2的比值表示熒光素酶強度。每次實驗設2個復孔，同一轉染實驗至少重復3次。 ④統(tǒng)計分析 采用GraphPad Prism4統(tǒng)計分析軟件進行數(shù)據(jù)處理，實驗數(shù)據(jù)以X±stdv表示，各組間比較采用t檢驗進行處理，當P<0．05時，統(tǒng)計學上具備顯著性差異。 二、ZHX2及ZHX2截短片段蛋白

8、對肝癌細胞的生長作用的研究 1．CCK-8檢測ZHX2及ZXH2截短片段對肝癌細胞生長的作用 取生長狀態(tài)良好的HepG2和HepG2．2．15細胞分別按1×104個/孔接種于96孔板中，次日ZHX2及其截短片段重組質粒p3ZHX2（242-501AA）-HA，p2ZHX2（242-338AA）-HA，分別轉染HepG2和HepG2．2．15細胞，轉染之后每隔24h，用CCK-8檢測細胞生長情況，連續(xù)檢測五天，繪制生長曲線

9、觀察ZHX2及其截短片段對細胞生長的影響。 2．集落形成實驗檢測ZHX2及其功能片段對肝癌細胞集落形成能力 取生長狀態(tài)良好的HepG2細胞按3×105個/孔接種于24孔板中，次日ZHX2全長及功能片段表達質粒瞬時轉染HepG2，轉染之后24h，將細胞經胰酶消化后，以適當?shù)募毎芏冉臃N于六孔板中，靜置培養(yǎng)2-3周，之后用龍膽紫染細胞，肉眼計數(shù)細胞克隆數(shù)，計算克隆形成率。 研究結果： 一、新型轉錄因子ZHX2

10、抑制AFP表達功能片段的尋找 1、新型轉錄抑制因子ZHX2不同截短片段的克隆表達 ①成功構建三個融合表達p1ZHX2（1-501AA）-HA，p2ZHX2（242-338AA）-HA和p3ZHX2（242-501AA）-HA 以含有全長ZHX2基因的pcDNA3．0-ZHX2-HA質粒為模板，PCR擴增ZHX2的三個不同截短片段，構建真核融合表達質粒，命名為：p1ZHX2（1-501AA）-HA，p2ZHX2（2

11、42-338AA）-HA和p3ZHX2（242-501AA）-HA。重組質粒DNA分別進行單、雙酶切，結果表明，KpnI/EcoRI雙酶切三種質粒，分別可獲得1587bp，338bp，827bp的目的基因片段，與預期大小一致；進一步DNA測序證明三個重組載體pcDNA-ZHX2（1-501AA）-HA，pcDNA-ZHX2（242-338AA）-HA，pcDNA-ZHX2（242-501AA）-HA構建成功。 ②Western

12、blot證實三種ZHX2片段的融合蛋白可以在真核細胞有效表達 Western blot結果顯示p1ZHX2（1-501AA）-HA，p2ZHX2（242-338AA）-HA和p3ZHX2（242-501AA）-HA轉染的HepG2，HepG2．2．15和COS-7細胞中均有明顯的特異性條帶，而轉染空質粒和空細胞的對照組均未見條帶，表明重組質?？梢栽诟伟┘毎岛头侵蘧G猴腎細胞中有效表達ZXH2不同截短片段。 2、不同截短

13、片段的ZHX2蛋白均可有效抑制AFP表達，其中242-501AA抑制作用最強 ①ZHX2不同截短片段對肝癌細胞中AFP表達的抑制作用 ZHX2不同截短片段重組質粒分別轉染HepG2，HepG2．2．15細胞48h后，收集上清，ELISA檢測上清中AFP的表達。結果顯示ZHX2不同截短片段均可以抑制肝癌細胞AFP表達，其中ZHX2（242-501AA）抑制作用最強，轉染p3ZHX2（242-501AA）-HA的HepG2

14、和HepG2．2．15細胞中AFP分別為1386．7±193．6ng/ml和1726．2±111．7ng/ml，較全長轉染組（1897．4±73．1 ng/ml，1896．1±81．1 ng/ml）顯著降低（p<0．05），抑制率為31．7％+2％。 ②．ZHX2不同截短片段對人AFP啟動子活性的抑制作用 ZHX2不同截短片段真核表達載體與pAFP269報告基因共轉染HepG2、HepG2．2．15細胞48h后，收集細

15、胞，雙熒光素酶報告基因檢測結果顯示，不同ZHX2截短片段均可有效抑制AFP核心啟動子活性，其中p3ZHX2（242-501AA）-HA作用最強，抑制率為49．9％±0．9％。 二、ZHX2及其截短片段蛋白抑制肝癌細胞的體外生長 1．ZHX2及其截短片段抑制肝癌細胞的生長 ZHX2及其截短片段表達質粒分別轉染HepG2．2．15和HepG2細胞后，CCK-8連續(xù)監(jiān)測五天，結果顯示ZHX2及其截短片段均可以抑制肝癌

16、細胞生長，其中242-501AA片段抑制作用最強，第5天時，較空載體轉染組，抑制率為15％。 2．ZHX2及其功能片段抑制肝癌細胞的集落形成 ZHX2及其功能片段表達質粒分別瞬時轉染HepG2細胞后，集落形成實驗結果顯示，ZHX2及其功能片段均具有體外抑制腫瘤細胞集落形成的能力，較ZHX2全長及空載體對照組相比，242-501AA片段抑制作用最強，較空載體組抑制率為83％。 結論及意義： 1．本研究成功

17、構建了三個可以在體外有效表達ZHX2不同截短片段融合蛋白的真核表達載體p1ZHX2（1-501AA）-HA，p2ZHX2（242-338AA）-HA，p3ZHX2（242-501AA）-HA，三種載體的構建為進一步研究ZHX2的功能提供了必要的條件。 2．本研究首次證明ZHX2（242-501AA）片段是對AFP有較強抑制作用的功能片段，為進一步深入研究ZHX2結構與功能奠定了基礎，同時也為發(fā)現(xiàn)肝癌治療新靶點提供實驗依據(jù)。