番茄YABBY家族轉(zhuǎn)錄因子的克隆、表達(dá)模式分析及其功能研究.pdf

1、YABBY蛋白家族是一種植物中所特有的轉(zhuǎn)錄因子,具有典型的N端C2C2型鋅指結(jié)構(gòu)域和C端螺旋環(huán)螺旋YABBY保守結(jié)構(gòu)域,在大多數(shù)的高等植物的生長(zhǎng)發(fā)育以及形態(tài)建成方面發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能。目前,該家族基因在模式生物擬南芥中的功能研究比較清楚,但在番茄中分子機(jī)制仍不是很清楚,研究YABBY家族基因在番茄生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程中的生物學(xué)功能具有重要意義。本研究篩選了番茄YABBY家族中的幾個(gè)緊密相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子分別命名為SlYABBY5、SlYABBY

2、1b和SlYABBY2a,利用qRT-PCR技術(shù)研究了此三個(gè)基因在番茄各組織中的表達(dá)模式分析;在ABA、ASA、IAA、GA3等外源激素處理以及低溫、高鹽和葉傷害等逆境脅迫下的表達(dá)分析。此外,分別構(gòu)建了SlYABBY1b和SlYABBY2a基因的沉默表達(dá)載體,以及SlYABBY2a超表達(dá)載體,通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的方法分別將SlYABBY1b和SlYABBY2a所構(gòu)建的沉默載體和超表達(dá)載體轉(zhuǎn)入番茄基因組中,經(jīng)抗生素篩選以及PCR鑒定,獲得相應(yīng)

3、的番茄轉(zhuǎn)基因株系,并對(duì)轉(zhuǎn)基因番茄的生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)行了表型觀察,進(jìn)行了相關(guān)基因的表達(dá)研究,對(duì)其功能進(jìn)行初步分析。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:
　　1、從NCBI數(shù)據(jù)庫中分別獲得 SlYABBY5(GenBank登錄號(hào):AK246138)、SlYABBY1b(GenBank登錄號(hào):AK326840)和 SlYABBY2a(GenBank登錄號(hào):AK328263)基因序列及其所編碼的氨基酸殘基,并利用RT-PCR的方法克隆了包含完整ORF的Sl

4、YABBY5基因,克隆了用于構(gòu)建沉默載體的SlYABBY1b和SlYABBY2a基因的特異片段和用于構(gòu)建超表達(dá)載體的包含完整ORF的SlYABBY2a的基因。所獲得的基因片段分別連入 pGEM?-T-easy-vector克隆載體,經(jīng) PCR驗(yàn)證和測(cè)序驗(yàn)證,所克隆的基因片段序列正確。
　　2、提取野生型番茄AC++各組織材料以及rin和Nr突變體的果實(shí)材料的總RNA,采用反轉(zhuǎn)錄酶和寡聚dT合成cDNA第一鏈。利用qRT-PCR的方

5、法進(jìn)行AC++野生型番茄各組織表達(dá)模式分析,利用Nr和rin的果實(shí)成熟突變體進(jìn)行果實(shí)成熟各時(shí)期表達(dá)模式分析。結(jié)果表明,SlYABBY5、SlYABBY1b和SlYABBY2a均在番茄根和莖中表達(dá)量極低,但在番茄葉組織、果實(shí)組織、萼片和花組織中均呈現(xiàn)組成型表達(dá),在不同組織中的表達(dá)有明顯的差異;在Nr和rin果實(shí)成熟突變體中與野生型番茄相比無明顯差異,且具有類似的表達(dá)趨勢(shì)。
　　3、選取四周大小的野生型番茄葉組織為材料,利用IAA、A

6、BA、GA3和ASA等激素處理番茄幼苗,qRT-PCR方法分析表明,SlYABBY5、SlYABBY1b和SlYABBY2a三個(gè)基因的表達(dá)均受到抑制;利用低溫、高鹽和機(jī)械損傷等處理幼苗,SlYABBY1b基因的表達(dá)也受到了明顯的抑制;而SlYABBY5和 SlYABBY2a基因受低溫脅迫的抑制,而其表達(dá)水平受高鹽和葉傷害脅迫的誘導(dǎo)。
　　4、利用所克隆的SlYABBY1b基因的特異序列構(gòu)建了RNAi介導(dǎo)的番茄pBIN19::SlY

7、ABBY1b沉默載體,經(jīng)PCR和酶切驗(yàn)證正確后,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將沉默載體重組入番茄基因組中,經(jīng)過Kan抗性篩選以及PCR驗(yàn)證的方法來篩選陽性轉(zhuǎn)基因株系,經(jīng)過驗(yàn)證獲得了5個(gè)陽性的轉(zhuǎn)基因株系;利用qRT-PCR技術(shù),檢測(cè)SlYABBY1b基因在所篩選出的所有的轉(zhuǎn)基因株系中的表達(dá)情況,檢測(cè)到該基因的表達(dá)水平均被明顯的下調(diào)。
　　5、利用所克隆的SlYABBY2a的特異基因片段構(gòu)建 RNAi介導(dǎo)的番茄pBIN19::SlYABBY2

8、a沉默載體,利用所克隆的包含完整ORF的SlYABBY2a的特異片段構(gòu)建pBI121::SlYABBY2a超表達(dá)載體,經(jīng)酶切和PCR驗(yàn)證正確后,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法侵染番茄子葉,分別將沉默和超表達(dá)載體重組入番茄基因組,采用Kan抗性篩選和PCR驗(yàn)證的方法篩選出陽性轉(zhuǎn)基因株系,驗(yàn)證分別獲得了2個(gè)超表達(dá)和5個(gè)沉默的轉(zhuǎn)基因株系;利用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)SlYABBY2a基因分別在超表達(dá)和沉默轉(zhuǎn)基因株系中的表達(dá)量,結(jié)果顯示,在2個(gè)超表達(dá)轉(zhuǎn)基因

9、株系中SlYABBY2a基因的表達(dá)水平均被明顯上調(diào),而該基因在沉默轉(zhuǎn)基因株系中其表達(dá)量明顯下降。
　　6、利用SlYABBY1b部分轉(zhuǎn)基因材料分別進(jìn)行生長(zhǎng)素途徑和赤霉素合成途徑相關(guān)基因的檢測(cè),研究表明,IAA3、IAA9、ARF7、ARF8和PIN4在RNAi介導(dǎo)的沉默轉(zhuǎn)基因番茄中表達(dá)水平與野生型番茄相比均被下調(diào)。其中,IAA3、IAA9和ARF8的表達(dá)在轉(zhuǎn)基因株系RNAi2＃中被下調(diào)的水平比RNAi4＃株系明顯。氧化酶基因GA2