肝細(xì)胞癌中轉(zhuǎn)錄抑制因子ZHX2靶基因的分析研究.pdf

1、肝癌是全世界癌癥死亡的重要原因。其發(fā)病率和死亡率一直位居于惡性腫瘤前列。肝癌往往在中晚期才被確診，而且病情進(jìn)展迅速，常常失去了有效的治療機(jī)會(huì)。肝癌的治療手段一般包括手術(shù)、放療、化療和綜合治療等?，F(xiàn)在的治療方式多采用手術(shù)切除，但是術(shù)后復(fù)發(fā)率很高。分子靶向治療是新興的治療手段，靶向藥物能夠提高肝癌的治療效果，但是長(zhǎng)遠(yuǎn)生存率仍然改觀不大，而且靶向藥物受益人群有限。因此，為肝癌的診斷和治療尋求有效的新靶標(biāo)是勢(shì)在必行的。
　　目的:

2、　　轉(zhuǎn)錄抑制因子ZHX2作為ZHX蛋白家族成員之一，在人體內(nèi)廣泛存在，不僅在體內(nèi)各種組織中有表達(dá)，而且對(duì)多種疾病中的關(guān)鍵基因表達(dá)具有調(diào)控作用。本課題組前期研究表明，ZHX2在肝癌組織和肝癌細(xì)胞系中低表達(dá)，提示可能為肝癌的抑制因子并且發(fā)現(xiàn)在肝癌組織和細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)ZHX2可以和細(xì)胞因子NF-YA結(jié)合調(diào)控下游基因的表達(dá)，從而抑制肝癌的發(fā)生發(fā)展。國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)研究報(bào)道ZHX2可以影響其他基因?qū)Ω伟┌l(fā)生發(fā)展的調(diào)控，但是具體調(diào)控機(jī)制仍不明確。因此，針對(duì)

3、肝癌中轉(zhuǎn)錄抑制因子ZHX2調(diào)控的機(jī)制進(jìn)行初步探討研究。分析肝細(xì)胞癌中轉(zhuǎn)錄抑制因子ZHX2轉(zhuǎn)錄調(diào)控特征，獲得ZHX2的靶基因;研究ZHX2和其靶基因在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及其臨床病理特征的關(guān)系，探討ZHX2與靶基因間的調(diào)控關(guān)系。
　　方法:
　　首先采用RT-PCR方法檢測(cè)肝癌細(xì)胞株HepG2、SMM7721、Be17402和正常肝細(xì)胞株LO2中ZHX2 mRNA表達(dá)的情況。接著利用ZHX2抗體進(jìn)行染色質(zhì)免疫共沉淀(chromat

4、in immunoprecipitation，ChIP)實(shí)驗(yàn)，將富集到的DNA樣品進(jìn)行高通量測(cè)序，得到肝細(xì)胞肝癌中ZHX2潛在靶基因，然后利用生物信息學(xué)進(jìn)行分析。最后通過(guò)免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)ZHX2和得到的靶基因PTEN、P53在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)，并分析它們與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系。
　　結(jié)果:
　　ZHX2 mRNA在3種肝癌細(xì)胞株中均有表達(dá)。對(duì)ChIP富集得到的DNA進(jìn)行分析，共得到1981個(gè)ZHX2結(jié)合位點(diǎn)的peak

5、s，含有3093個(gè)結(jié)合的基因。ZHX2的peaks主要分布在1、2、3、5、7號(hào)染色體，在基因元件上的分布主要在基因間區(qū)、內(nèi)含子區(qū)、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游和啟動(dòng)子區(qū)。對(duì)ZHX2結(jié)合在啟動(dòng)子區(qū)的232個(gè)基因進(jìn)行基因功能(gene ontology，GO)注釋?zhuān)l(fā)現(xiàn)ZHX2參與了與生物調(diào)節(jié)、代謝進(jìn)程和分子調(diào)節(jié)功能等有關(guān)的生物功能，和形成血液微粒、近心異染色質(zhì)等有關(guān)的細(xì)胞組分，在分子功能上與GTP酶的激活、調(diào)節(jié)和其他酶的激活有關(guān)的過(guò)程。然后進(jìn)行KE

6、GGpathway分析顯示其中一些靶基因可能富集于4條通路，分別是3條傳染性疾病的通路和1條吞噬通路。相對(duì)于肝癌癌旁組織，ZHX2在肝細(xì)胞癌組織中低表達(dá)(P=0.042)，與血清AFP值相關(guān)(P=0.041); PTEN在癌組織中低表達(dá)(P=0.000)，分別與腫瘤的分化程度和血清AFP值有關(guān)(P=0.025，P=0.028);P53在癌組織中高表達(dá)(P=0.000)，與腫瘤的分化程度有關(guān)(P=0.045)。ZHX2與PTEN存在相關(guān)性

7、(r=0.258，P=0.031)。
　　結(jié)論:
　　本研究是首次采用ChIP-Seq技術(shù)從全基因組水平解析ZHX2在肝癌中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控的靶基因。發(fā)現(xiàn)ZHX2除了與啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合外，還可以和基因間區(qū)的遠(yuǎn)距離調(diào)控區(qū)域結(jié)合調(diào)控靶基因。對(duì)啟動(dòng)子區(qū)域的靶基因進(jìn)行基因富集分析顯示結(jié)合的靶基因與代謝過(guò)程、生物調(diào)控過(guò)程等有關(guān);富集通路分析提示富集靶基因可能影響了傳染性疾病和吞噬相關(guān)調(diào)控。
　　ZHX2與PTEN、P53在肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)