轉(zhuǎn)錄因子Nanog基因在乳腺癌干細(xì)胞中的表達(dá)及其功能研究.pdf

1、乳腺癌是嚴(yán)重危害女性生命健康的惡性腫瘤。近年來，越來越多的證據(jù)表明腫瘤中存在著一群比例較低的細(xì)胞，卻可能與腫瘤的進展、耐藥、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移等關(guān)系密切，它們被命名為腫瘤干細(xì)胞。轉(zhuǎn)錄因子Nanog最初發(fā)現(xiàn)于胚胎干細(xì)胞中，它是維持胚胎干細(xì)胞自我更新和多能性的關(guān)鍵因子，是干細(xì)胞自我更新、增殖，同時保持其分化潛能所必需的。最新的研究表明，Nanog在包括乳腺癌在內(nèi)的多種腫瘤中的表達(dá)水平明顯升高，它在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到了重要的調(diào)控作用，提示它可能成為

2、一個潛在的治療靶點。
　　目前已知，Nanog在胚胎干細(xì)胞中的功能在于維持其自我更新和多向分化潛能，而在腫瘤干細(xì)胞，特別是乳腺癌干細(xì)胞中的表達(dá)特征及功能一直處于未知狀態(tài)，尚未見文獻(xiàn)報道。Nanog在乳腺癌干細(xì)胞中是否也具有其在胚胎干細(xì)胞中的相似功能？這已成為基于Nanog為靶點的乳腺癌干細(xì)胞靶向治療研究進程中首先需要解答的問題。為此，本課題就轉(zhuǎn)錄因子Nanog基因在乳腺癌干細(xì)胞中的表達(dá)特征及其所具有的功能等問題進行了初步研究。

3、r>　　目的:1.以乳腺癌細(xì)胞系為模型，建立以細(xì)胞表面標(biāo)志物CD44+CD24-和懸浮微球體培養(yǎng)的乳腺癌干細(xì)胞分選、富集的方法，闡明轉(zhuǎn)錄因子Nanog基因及其不同轉(zhuǎn)錄本在乳腺癌干細(xì)胞中的表達(dá)特征;2.針對人Nanog基因序列，設(shè)計并構(gòu)建Nanog-RNAi慢病毒載體，為后續(xù)基因功能研究奠定基礎(chǔ);3.分析轉(zhuǎn)錄因子Nanog在乳腺癌干細(xì)胞中所具有的功能，對以Nanog為靶點的乳腺癌干細(xì)胞靶向治療進行初步探索。
　　方法:1.Nanog

4、在乳腺癌干細(xì)胞中的表達(dá):1）以細(xì)胞表面標(biāo)志物CD44+CD24-對乳腺癌細(xì)胞系進行FACS分選;2）體外無血清干細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境對乳腺癌細(xì)胞系進行懸浮微球體培養(yǎng)以富集乳腺癌干細(xì)胞;3）Western Blot和免疫熒光檢測微球體和貼壁細(xì)胞中Nanog的表達(dá)差異及其細(xì)胞定位;4）Real-time PCR檢測Nanog、Oct4、Sox2、Klf4、CD44、Wnt2、Notch1和ABCG2等干細(xì)胞相關(guān)基因在CD44+CD24-和non-C

5、D44+CD24-細(xì)胞中的表達(dá)差異，以及Nanog三個不同轉(zhuǎn)錄本在CD44+CD24-細(xì)胞中的表達(dá)差異。
　　2.Nanog-RNAi慢病毒載體的構(gòu)建與鑒定:1）針對人Nanog基因的siRNA靶點設(shè)計4個靶序列，合成單鏈DNA oligo片段后，將單鏈DNA oligo的正義鏈和反義鏈混合物制備成雙鏈DNA oligo;2）使用AgeⅠ和EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶對慢病毒質(zhì)粒pGC-LV載體進行雙酶切后，與制備的雙鏈DNA olig

6、o連接，構(gòu)成重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，對生成的陽性克隆進行PCR鑒定及測序;3）采用三質(zhì)粒系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，收集細(xì)胞上清液濃縮并測定病毒滴度;4）用構(gòu)建的Nanog-shRNA慢病毒載體感染目的細(xì)胞，Real-time PCR進行內(nèi)源性篩靶。
　　3.Nanog在乳腺癌干細(xì)胞中的功能:1）CCK-8法和克隆形成實驗用于評價shNanog-LV對乳腺癌細(xì)胞增殖的影響;2）微球體培養(yǎng)用于評價shNanog-LV對乳腺癌細(xì)胞微球體

7、形成能力的影響;3）FACS分析用于評價shNanog-LV對乳腺癌細(xì)胞CD44+CD24-比例的影響;4）Real-time PCR用于檢測shNanog-LV對乳腺癌細(xì)胞分化標(biāo)志物和干細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)的影響。
　　結(jié)果:1.Nanog在乳腺癌干細(xì)胞中的表達(dá):1）不同分子分型的乳腺癌細(xì)胞系中CD44+CD24-細(xì)胞比例不同:MCF-7細(xì)胞中CD44+CD24-的比例為3.38±0.467％，SK-BR-3細(xì)胞中CD44+CD24

8、-的比例為0.392±0.113％，MDA-MB-231細(xì)胞中CD44+CD24-的比例為89.5±2.13％;2）不同分子分型乳腺癌細(xì)胞系的微球體形成能力不同:MCF-7和SK-BR-3細(xì)胞可以在干細(xì)胞培養(yǎng)基中形成典型的微球體結(jié)構(gòu)，MDA-MB-231細(xì)胞則不能;3）微球體細(xì)胞可以在體外進行傳代培養(yǎng)，形成與親代形態(tài)結(jié)構(gòu)相似的微球體;4）Nanog在MCF-7細(xì)胞微球體中的表達(dá)水平高于貼壁細(xì)胞;5) MCF-7細(xì)胞中CD44+CD24-

9、比non-CD44+CD24-亞群細(xì)胞具有更強的微球體形成能力;6）MCF-7細(xì)胞中CD44+CD24-比non-CD44+CD24-亞群細(xì)胞高表達(dá)Nanog、Oct4、Sox2、Klf4、CD44、Wnt2、Notch1和ABCG2等干細(xì)胞相關(guān)基因;7）Nanogp8在CD44+CD24-的MCF-7細(xì)胞中表達(dá)水平明顯高于Nanog1和Nanog2;8）Nanog主要表達(dá)于MCF-7細(xì)胞的細(xì)胞核中，但細(xì)胞質(zhì)也有一定程度的表達(dá)。

10、　　2.Nanog-RNAi慢病毒載體的構(gòu)建與鑒定:1）設(shè)計構(gòu)建的重組Nanog-RNAi慢病毒質(zhì)粒經(jīng)PCR和測序驗證，設(shè)計的shNanog序列成功插入;2）病毒滴度測定結(jié)果分別為4E+8、8E+8、1E+9和9E+8;3）Real-time PCR內(nèi)源性篩靶確定LV-Nanog-RNAi(4515-1)對MCF-7細(xì)胞中Nanog基因表達(dá)的抑制率最高。
　　3.Nanog在乳腺癌干細(xì)胞中的功能:1）構(gòu)建的shNanog慢病毒載體

11、可以有效抑制Nanog的表達(dá)水平;2)shNanog可以抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和克隆形成;3)shNanog可以抑制MCF-7細(xì)胞的微球體形成能力;4）shNanog可以減少乳腺癌細(xì)胞中CD44+CD24-的比例;5）shNanog可以上調(diào)乳腺癌細(xì)胞分化標(biāo)志物CK14和CK18的表達(dá)水平，下調(diào)Oct4、Sox2、Klf4、CD44、Wnt2、Notch1和ABCG2等干細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)水平。
　　結(jié)論:1.Nanog在乳腺癌干細(xì)胞