CpG-c41對內(nèi)膜型TLRs的交互干擾及其機制探究.pdf

1、Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)是固有免疫系統(tǒng)中一類重要的模式識別受體(pattern recognition receptors，PRRs)，通過識別病原相關(guān)模式分子(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)啟動一系列炎癥反應(yīng)，以清除入侵的病原體。病原體攜帶的多種PAMPs往往同時活化多種TLRs，由于不同的TLRs介導(dǎo)的下游信號通路，彼此之間相互獨立

2、，但又存在共同的匯聚點，由此，多種TLRs介導(dǎo)的信號之間就會發(fā)交互串擾，表現(xiàn)出相互疊加、相互協(xié)同或相互拮抗等不同的免疫效應(yīng)。這對免疫調(diào)節(jié)具有特別的意義，然而，其背后的作用機制仍不完全清楚。
　　一般情況下，TLRs所介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)能夠幫助機體清除病原體，維持免疫穩(wěn)態(tài)。但是，如果TLRs被過度激活，就會導(dǎo)致自身免疫疾病的發(fā)生。前期研究中我們課題組發(fā)現(xiàn)的無免疫刺激性CpG-ODN c41分子，一段包含未甲基化CpG結(jié)構(gòu)的20bp寡聚核

3、苷酸(CpG-ODN)序列（5'-TGGCGCGCACCCACGGCCTG-3'），作為TLR9的拮抗劑，能夠保護小鼠免受刺激性CpG-ODN的攻擊，表現(xiàn)出一定的抗炎作用。本研究利用TLR9拮抗劑CpG-c41分子，在不激活TLR9信號通路的條件下，探究CpG-c41與其他TLRs間的交互作用，并利用CpG-c41的無免疫刺激性，從一個全新的視角，探究其交互串擾機制，拓展我們對固有免疫中TLRs間免疫調(diào)節(jié)模式的理解。
　　目的:<

4、br>　　明確TLR9拮抗劑CpG-c41分子對其他TLRs的交互影響，利用CpG-c41的無免疫刺激性，明確交互影響發(fā)生的環(huán)節(jié)和作用機制。
　　方法:
　　1.通過ELISA實驗觀察CpG-c41對TLR1/2激動劑Pam3 CSK4、TLR2激動劑HKLM、TLR3激動劑poly(I∶C)、TLR7/8激動劑ssRNA120和TLR9激動劑CpG-1826誘導(dǎo)的前炎癥細胞因子TNF-α、IL-6釋放的影響，明確CpG-c

5、41分子與其他TLRs間的交互作用。
　　2.通過激光共聚焦顯微鏡，觀察CpG-c41分子的吞噬入胞，掌握CpG-c41的內(nèi)化過程;利用免疫熒光技術(shù)探究CpG-c41入胞后的轉(zhuǎn)運過程;采用CpG-c41雙標熒光探針（3'Cy3作為熒光報告基團、5'BHQ-1作為熒光淬滅基團）研究CpG-c41在胞內(nèi)的代謝過程。
　　3.利用免疫熒光技術(shù)，觀察比較CpG-c41和其他TLR激動劑內(nèi)化競爭和受體競爭情況，探究CpG-c41交互串

6、擾的具體作用機制。
　　4.通過ELISA實驗，探究CpG-c41是否影響激動劑誘導(dǎo)Raw264.7細胞釋放前炎癥細胞因子TNF-α，明確CpG-c41對小鼠巨噬細胞的免疫應(yīng)答能力的影響。
　　結(jié)果:
　　1.CpG-c41分子能夠有效抑制TLR3、TLR7/8和TLR9（內(nèi)膜型TLRs）誘導(dǎo)的前炎癥細胞因子TNF-α、IL-6的釋放，但不影響TLR1和TLR2（胞膜型TLRs）誘導(dǎo)的TNF-α、IL-6的釋放。

7、>　　2.3'Cy3-c41（3'端標記Cy3的CpG-c41，紅色標記）作用Raw264.7細胞5min后，胞內(nèi)開始出現(xiàn)紅色熒光，之后紅色熒光分子逐漸增多，約11h后胞內(nèi)的熒光強度達到峰值，隨后趨于穩(wěn)定，進入平臺期，呈飽和狀態(tài)。
　　3.胞內(nèi)的3'FAM-c41（3'端標記FAM的CpG-c41，綠色標記）達飽和狀態(tài)后，再加入3'Cy3-c41，發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)的綠色熒光逐漸減弱，紅色熒光逐漸增強，即先前內(nèi)化的3'FAM-c41出胞，而

8、環(huán)境中的3'Cy3-c41繼續(xù)入胞，說明CpG-c41達平臺期后處于一種動態(tài)平衡過程。
　　4.不同熒光標記的CpG-c41作用細胞后，對于Cy3標記，無論Cy3標記在CpG-c41的3'端，還是5'端，均能觀察到胞內(nèi)出現(xiàn)紅色熒光;對于FAM標記，可以觀察到3'FAM-c41和5'3'FAM-c41（5'，3'端同時標記FAM的CpG-c41）入胞后的熒光分布，但是，觀察不到5'FAM-c41的綠色熒光，而5'FAM-c41仍然能

9、有效抑制CpG-1826釋放前炎癥因子TNF-α，說明5'FAM-c41依然入胞，只是通過磷酸二酯鍵連接的5'FAM發(fā)生了類似于核酸外切酶的作用，熒光基團在入胞的過程中丟失了。
　　5.CpG-c41雙標熒光探針（同時標記熒光基團和淬滅基團）作用Raw264.7細胞40min后，胞內(nèi)開始出現(xiàn)紅色熒光分子，說明CpG-c41作用細胞40min后開始降解;CpG-c41內(nèi)化7min后定位于網(wǎng)格蛋白，15min與早期內(nèi)體共定位，30mi

10、n與溶酶體共定位，提示CpG-c41的內(nèi)化轉(zhuǎn)運需要網(wǎng)格蛋白的參與，首先轉(zhuǎn)運到早期內(nèi)體，30min后轉(zhuǎn)運到溶酶體，40min后開始降解。
　　6.CPG-1826和CpG-c41都與TLR9存在共定位現(xiàn)象。與3'Cy3標記的CPG-1826組相比，CpG-c41加入后，CPG-1826與TLR9無共定位現(xiàn)象。
　　7.用FITC標記的Poly(I∶C)作用Raw264.7細胞，發(fā)現(xiàn)5min后胞內(nèi)出現(xiàn)綠色熒光分子，之后逐漸增多;

11、用FITC標記的Poly(I∶C)、3'Cy3-c41同時作用Raw264.7細胞，發(fā)現(xiàn)5min后胞內(nèi)出現(xiàn)紅色熒光分子3'Cy3-c41，6h后才觀察到綠色熒光分子即FITC標記的Poly(I∶C)。與單獨的FITC標記的Poly(I∶C)相比，CpG-c41的加入使Poly(I∶C)的入胞時間延遲了。
　　8.ssRNA120經(jīng)DOTAP包裹后，有效誘導(dǎo)HEK293/TLR7和HEK293/TLR8細胞釋放炎癥因子IL-8，Cp

12、G-c41的加入明顯抑制了IL-8的釋放;當ssRNA120和CpG-c41同時用DOTAP包裹后，CpG-c41同樣能干擾ssRNA120對TLR7和TLR8的活化，說明干擾環(huán)節(jié)與胞膜資源爭奪無關(guān)。
　　9.免疫熒光實驗表明，3'Cy3-c41與TLR7、TLR8存在明顯的共定位現(xiàn)象。
　　10.在只表達TLR3，TLR7，TLR8和TLR9，不表達CD14的HEK293細胞中，CpG-c41的加入明顯抑制上述相應(yīng)激動劑誘

13、導(dǎo)的NF-κB的活化。
　　11.分別給予激動劑Poly(I∶C)/ssRNA120/CpG-1826初次刺激，Raw264.7細胞再次接受Poly(I∶C)/ssRNA120/CpG-1826刺激后，TNF-α的釋放量較Medium組明顯減少，即TLR激動劑的刺激會導(dǎo)致細胞免疫應(yīng)答能力衰減;然而，當初次給予Medium或CpG-c41處理，細胞再次接受Poly(I∶ C)/ssRNA120/CpG-1826刺激后，與Medium

14、組相比，CpG-c41組正常釋放TNF-α，即CpG-c41與Medium一樣，不影響細胞免疫應(yīng)答能力。
　　結(jié)論:
　　1.CpG-c41選擇性干擾內(nèi)膜型TLRs活化，對胞膜型TLRs沒有影響。
　　CpG-c41發(fā)揮的多重免疫抑制效應(yīng)與TLRs的分布有關(guān)。雖然胞膜型TLR1、TLR2與內(nèi)膜型TLR7/8和TLR9均依賴MyD88信號通路，但CpG-c41選擇性干擾內(nèi)膜型TLRs，而對胞膜型TLRs無影響。另一方面，

15、盡管TLR3與TLR7/8、TLR9下游信號通路不同，但CpG-c41均能抑制這幾種內(nèi)膜型TLR的活化。由此說明，CpG-c41的交互干擾效應(yīng)與TLRs下游信號通路無關(guān)，其串擾發(fā)生在信號級聯(lián)啟動以前。
　　2.CpG-c41的內(nèi)化轉(zhuǎn)運代謝過程。
　　3'Cy3-c41作用Raw264.7細胞5min后開始入胞，約11h后進入平臺期，呈飽和狀態(tài)。在CpG-c41吞噬入胞的過程中，5'末端5'碳位點發(fā)揮了關(guān)鍵作用。CpG-c41

16、內(nèi)化15min后轉(zhuǎn)運到早期內(nèi)體，30min后轉(zhuǎn)運到溶酶體，40min左右開始降解。由此，CpG-c41的干預(yù)環(huán)節(jié)發(fā)生在CpG-c41內(nèi)化入胞大致40min之前。CpG-c41的內(nèi)化是一種動態(tài)過程，即先前入胞的分子及降解產(chǎn)物不會在胞內(nèi)滯留，提示CpG-c41的干擾效應(yīng)與內(nèi)體飽和無關(guān)。
　　3.CpG-c41對內(nèi)膜型TLRs的干擾機制
　　針對不同的TLR，CpG-c41的干預(yù)方式也不相同，在入胞階段，CpG-c41通過與TLR

17、3激動劑Poly(I∶C)競爭入胞干擾TLR3活化;在識別階段，CpG-c41通過與TLR7/8或TLR9競爭性結(jié)合發(fā)揮干擾作用。以往普遍認為TLR7/8特異性識別ssRNA，但本研究發(fā)現(xiàn)它們也能識別ssDNA，說明TLR7/8對配體識別的特異性是相對的，具有一定的兼容性。
　　此外，CD14作為這四種內(nèi)膜型TLRs一種共同的輔助受體，極有可能參與了交互干擾過程。本研究明確地排除了CD14參與CpG-c41的多重免疫抑制效應(yīng)。