加味三棱丸對(duì)大鼠異位內(nèi)膜細(xì)胞凋亡及其機(jī)制的研究.pdf

1、子宮內(nèi)膜異位癥(Endometriosis，EMS，簡(jiǎn)稱內(nèi)異癥)是婦科頑癥，病因復(fù)雜，且與惡性腫瘤密切相關(guān)，被世界衛(wèi)生組織(WHO)列為疑難病癥之一。目前治療本病多以激素類藥物、手術(shù)為主。由于長(zhǎng)期激素治療伴隨的假孕、假絕經(jīng)現(xiàn)象，以及手術(shù)治療適應(yīng)癥的限制和并發(fā)癥的產(chǎn)生，給患者身體和心理健康造成了許多不良影響。中醫(yī)藥根據(jù)辯證論治，在緩解臨床癥狀、調(diào)經(jīng)助孕等方面有其獨(dú)特療效，且毒副作用小，可長(zhǎng)期服用。因此尋找療效可靠的中藥制劑，并探討其作用機(jī)

2、理具有重要的研究?jī)r(jià)值。三棱丸最早見于《經(jīng)驗(yàn)良方》，是由三棱、莪術(shù)兩味活血化瘀中藥組成，用于瘀血經(jīng)閉，行經(jīng)腹痛，癥瘕積聚，食積腹痛。異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞在宮腔外種植并存活，與其自發(fā)性凋亡減弱或?qū)Φ蛲鲂盘?hào)不敏感等特性改變有關(guān)。本課題從細(xì)胞凋亡的角度觀察活血化瘀方加味三棱丸主要成份(簡(jiǎn)稱SLW)治療子宮內(nèi)膜異位癥的療效并探討其作用機(jī)制。 目的觀察加味三棱丸主要成分對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥大鼠異位內(nèi)膜的發(fā)展及其細(xì)胞凋亡的影響；觀察加味三棱丸主要成分

3、對(duì)抗凋亡基因Bcl-2 mRNA和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的基因Fas mRNA的作用。探討加味三棱丸主要成分治療子宮內(nèi)膜異位癥的療效及誘導(dǎo)異位內(nèi)膜細(xì)胞凋亡的機(jī)制。 方法： 1、動(dòng)物模型的制作選取健康雌性Wistar大鼠50只，體重180～220g，每天定時(shí)觀察陰道細(xì)胞涂片，選擇動(dòng)情周期4～5天并連續(xù)有2個(gè)動(dòng)情周期的雌性大鼠，于動(dòng)情期(陰道細(xì)胞涂片為角化上皮細(xì)胞時(shí))行造模手術(shù)。以5％水合氯醛(0.7ml/100g)腹腔注射麻醉，常規(guī)

4、消毒，在無菌條件下開腹，結(jié)扎右側(cè)子宮兩端后，從遠(yuǎn)端剪取長(zhǎng)約1.5cm的子宮段，剔除脂肪組織，剪成5mm×5mm的子宮組織3塊。一塊送病理檢驗(yàn)(確證為子宮組織)，另外兩塊靠近腹膜血管處，縫于腹壁，以粘膜面朝向腹膜，漿膜面朝向腹腔，關(guān)腹。每鼠腹腔注射慶大霉素0.1ml×3天。正常清潔飼養(yǎng)。 2、模型納入的標(biāo)準(zhǔn)建模后4周，觀察陰道細(xì)胞學(xué)涂片，第二次剖腹觀察異位子宮內(nèi)膜的生長(zhǎng)情況，并用游標(biāo)卡尺測(cè)量移植灶大小。如果移植灶體積增大，體積≥8

5、mm3，呈隆起透亮的結(jié)節(jié)狀、囊狀，被結(jié)締組織或大網(wǎng)膜覆蓋并有血管形成，內(nèi)有淡黃色透明囊液積聚。切取移植灶送檢，證實(shí)移植灶中有子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞、腺體及間質(zhì)的生長(zhǎng)。 3、試驗(yàn)分組與用藥除正常對(duì)照組外，另將造模成功的大鼠隨機(jī)分為SLW0.11mg.kg-1.d-1組、0.34mg.kg-1.d-1組、1.02mg.kg-1.d-1組、0.5mg.kg-1·d-1孕三烯酮組、模型對(duì)照組，灌胃給藥，每天1次，連續(xù)4周。 4、檢測(cè)指

6、標(biāo) 4周后結(jié)束治療，觀察陰道細(xì)胞學(xué)涂片后處死大鼠，第三次剖腹觀察異位內(nèi)膜生長(zhǎng)情況，并測(cè)量移植灶體積。切取在位子宮與異位子宮內(nèi)膜， HE巳染色進(jìn)行形態(tài)學(xué)病理檢察。TUNEL法檢測(cè)異位內(nèi)膜細(xì)胞凋亡，原位雜交檢測(cè)凋亡調(diào)控基因Bcl-2和Fas mRNA的表達(dá)。 結(jié)果： 1、SLW對(duì)大鼠異位內(nèi)膜組織生長(zhǎng)的影響用藥4周后，模型對(duì)照組移植灶體積比4周前略大，呈隆起透亮的小泡狀，表面血管清晰可見，內(nèi)部充滿積液。而孕三烯酮組和S

7、LW0.11 mg.kg-1.d-1組、0.34mg.kg-1.d-1組、1.02mg.kg-1.d-1組移植灶體積明顯縮小，囊泡表面顏色黯淡，個(gè)別移植灶顏色泛黃，呈現(xiàn)萎縮狀。 2、SLW對(duì)大鼠異位內(nèi)膜組織顯微結(jié)構(gòu)的影響HE染色，光鏡下觀察。移植的子宮內(nèi)膜組織成活，形成的囊壁由內(nèi)向外分別為上皮細(xì)胞層、間質(zhì)細(xì)胞層及少量纖維結(jié)締組織，囊內(nèi)為少量漂浮的白細(xì)胞和黏液。模型對(duì)照組異位內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞呈高柱狀或矮柱狀，排列在囊泡內(nèi)腔面，細(xì)胞間

8、連接較緊密，細(xì)胞核大，呈橢圓形，位于基底部，胞漿豐富。內(nèi)膜間質(zhì)也豐富，其中有個(gè)別部位上皮層內(nèi)陷形成假腺體。SLW1.02mg.kg-1.d-1組、0.34mg.kg-1.d-1組和孕三烯酮組，內(nèi)膜腺上皮層明顯變薄，細(xì)胞呈矮柱狀甚至扁平狀，松散排列，核不規(guī)則，位置不定，胞漿嗜堿性增加。內(nèi)膜間質(zhì)也明顯減少，腺體少甚至缺失。 3、SLW對(duì)大鼠異位內(nèi)膜組織體積的影響用藥前，各組大鼠異位內(nèi)膜病灶體積經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理無顯著性差異(P＞0.05)

9、。用藥4周后，孕三烯酮組和SLW1.02mg.kg-1.d-1組、0.34mg.kg-1.d-1組、0.11mg.kg-1.d-1組異位內(nèi)膜體積分別為17.01mm3、1 8.42mm3、25.90mm3、58.34mm3，體積明顯縮小，與模型對(duì)照組102.17mm3相比均有顯著性差異(P＜0.05)。而模型對(duì)照組異位內(nèi)膜體積比4周前略有增加，但無顯著性差異(P＞0.05)。結(jié)果顯示：加味三棱丸可顯著縮小異位內(nèi)膜體積。 4、SLW對(duì)大鼠

10、異位內(nèi)膜細(xì)胞凋亡的影響用藥4周后，異位內(nèi)膜組織切片在熒光顯微鏡下，以520±20nm波長(zhǎng)觀察，可見綠色熒光所標(biāo)記的凋亡細(xì)胞。共聚焦激光掃描，顯示凋亡細(xì)胞核裂解，凋亡小體(凋亡細(xì)胞特征性的形態(tài)學(xué)改變)形成。模型對(duì)照組平均熒光強(qiáng)度值0.1457比正常對(duì)照組0.1892顯著降低(P＜0.05)，模型對(duì)照組異位內(nèi)膜細(xì)胞凋亡減少，生長(zhǎng)失衡。而孕三烯酮組和SLW 1.02mg.kg-1.d-1組、0.34mg.kg-1.d-1組、0.11 mg.k

11、g-1.d-1組平均熒光強(qiáng)度值分別為0.2315、0.2246、0.2209、0.1955，與模型對(duì)照組0.1457相比，其平均熒光強(qiáng)度值均顯著增高(P＜0.05)。結(jié)果顯示：加味三棱丸能促進(jìn)異位內(nèi)膜細(xì)胞凋亡。 5、SLw對(duì)大鼠異位內(nèi)膜組織Bcl-2 mRNA表達(dá)的影響用藥4周后，原位雜交結(jié)果顯示，抗凋亡基因Bcl- mRNA陽性表達(dá)的細(xì)胞染色為棕黃色，主要分布在腺上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的胞漿、胞膜和核膜。模型對(duì)照組異位內(nèi)膜組織Bc

12、l-2 mRNA呈陽性表達(dá)，且多數(shù)為強(qiáng)陽性表達(dá)，其平均光密度值0.1728與正常對(duì)照組0.1491相比有顯著性差異(P＜0.05)。孕三烯酮組和SLW1.02mg.kg-1.d-1組、0.34mg.kg-1.d-1組、0.11mg.kg-1.d-1組異位內(nèi)膜組織Bcl-2 mRNA的表達(dá)較模型對(duì)照組顯著減少，其平均光密度值分別為0.1014、0.1055、0.1102、0.1370，與模型對(duì)照組0.1728比較均有顯著性差異(P＜0.0

13、5)。結(jié)果顯示：加味三棱丸能降低異位內(nèi)膜組織抗凋亡基因Bcl-2 mRNA的表達(dá)，從而促進(jìn)異位內(nèi)膜細(xì)胞凋亡。 6、SLW對(duì)大鼠異位內(nèi)膜組織Fas mRNA表達(dá)的影響用藥4周后，原位雜交結(jié)果顯示，凋亡基因Fas mRNA陽性表達(dá)的細(xì)胞染色為棕黃色，主要分布在內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞的胞漿、胞膜。模型對(duì)照組異位內(nèi)膜組織Fas mRNA僅有少量表達(dá)，且染色較淺，其平均光密度值0.0883與正常對(duì)照組0.0912相比無顯著性差異(P＞0.05)。而

14、各治療組異位內(nèi)膜組織Fas mRNA的表達(dá)均較模型對(duì)照組有不同程度的增加，孕三烯酮組和SLW1.02mg.kg-1.d-1組、0.34mg.kg-1.d-1組、0.11mg.kg-1.d-1組平均光密度值(0.1242、0.1206、0.1164、0.0966)與模型對(duì)照組(0.0883)比較，差異有顯著性(P＜0.05)。結(jié)果顯示：加味三棱丸能增加異位內(nèi)膜組織凋亡基因Fas mRNA的表達(dá)，從而誘導(dǎo)異位內(nèi)膜細(xì)胞凋亡。 結(jié)論：