shRNA誘導(dǎo)14-3-3σ基因啟動子甲基化與基因表達(dá)沉默的研究.pdf

1、本文我們首先研究了14-3-3δ基因在動物細(xì)胞中的一些表觀遺傳特性，其次我們還向A549細(xì)胞株中引入siRNA，對比了siRNA引入前后A549細(xì)胞株中14-3-3δ基因表觀遺傳模式的改變情況，通過本課題的研究，主要得到以下結(jié)論：1.14-3-3δ基因的表達(dá)具有組織特異性，這種表達(dá)的組織特異性受表觀遺傳因素的控制，其啟動子區(qū)DNA的高甲基化、組蛋白的去乙?；瘯种苹虻谋磉_(dá)；2.這段與14-3-3δ基因啟動子區(qū)同源的siRNA誘導(dǎo)14-

2、3-3δ基因啟動子區(qū)表觀遺傳模式的改變，誘導(dǎo)了14-3-3δ基因啟動子區(qū)CpG島的再甲基化，引發(fā)了該區(qū)域組蛋白的去乙?；磻?yīng)，14-3-3δ基因表觀遺傳模式的改變引發(fā)了基因表達(dá)的下降。本課題的完成將有助于闡明動物細(xì)胞中siRNA誘導(dǎo)甲基化的機制，為腫瘤的治療提供新的方法提供實驗數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。 表觀遺傳學(xué)(epigenetics)這個術(shù)語最早是由ConradWaddington于上個世紀(jì)40年代提出，ConradWadding

3、ton用它來描述基因與其環(huán)境的關(guān)系。起初，表觀遺傳學(xué)的主要研究內(nèi)容是描述了異染色質(zhì)(heterochromatin)這種基因組形式，其主要特點是低基因密度、高重復(fù)序列和細(xì)胞周期過程中最晚復(fù)制。接著，表觀遺傳研究發(fā)現(xiàn)異染色質(zhì)和常染色質(zhì)(euchromatin)的差別是與DNA甲基化(DNAmethylation)和組蛋白修飾密切相關(guān)，并且發(fā)現(xiàn)這種差別決定了基因活性的特定狀態(tài)，由此引出了表觀遺傳密碼(epigeneticcode)這個概念，

4、表觀遺傳密碼決定了染色質(zhì)的狀態(tài)，從而影響基因的表達(dá)。最近的研究發(fā)現(xiàn)了一種表觀遺傳記憶系統(tǒng)(epigeneticmemousystem)，這是一個由蛋白pcG和trxG介導(dǎo)用于保持染色質(zhì)沉默狀態(tài)的系統(tǒng)，shRNAs(shorthairpinRNAs)通過RNAi途徑在異染色質(zhì)形成中發(fā)揮了很重要的作用?；虮磉_(dá)的可遺傳改變比如發(fā)生在植物中的副突變、哺乳動物中的X染色體失活、基因印跡(genomicimprinting)等這些基因沉默現(xiàn)象預(yù)示

5、了個體中復(fù)雜的基因表達(dá)調(diào)控，根據(jù)目前該領(lǐng)域的研究現(xiàn)狀，可以將表觀遺傳學(xué)的主要研究內(nèi)容和學(xué)科范疇簡單描述為：不發(fā)生核酸序列改變的基因表達(dá)可遺傳改變的研究。 表觀遺傳現(xiàn)象是多細(xì)胞生命中普遍存在的一種現(xiàn)象，多細(xì)胞生命體在發(fā)育過程中，各種組織細(xì)胞的基因表達(dá)譜不斷發(fā)生重構(gòu)改變，這一系列重構(gòu)變化并沒有伴隨著基因組DNA序列的改變，而是涉及到DNA環(huán)境的改變，這些DNA環(huán)境包括：染色質(zhì)折疊形式、DNA所處的核位置、核小體包裝形式、組蛋白尾巴

6、的共價修飾(如乙?；?、甲基化、磷酸化等)、DNA甲基化。其中DNA甲基化被認(rèn)為是影響表觀遺傳的主要因素，自從1948年被首次發(fā)現(xiàn)以來，DNA甲基化就引起科學(xué)界的濃厚興趣，5-mC甚至被稱為基因組的第五個堿基。DNA甲基化在細(xì)胞生物學(xué)過程中發(fā)揮了重要作用，主要體現(xiàn)在以下幾個方面：調(diào)節(jié)組織特異型基因表達(dá)、基因印跡、X染色體失活、腫瘤相關(guān)基因表達(dá)沉默、抑制轉(zhuǎn)座元件(transposableelements)和內(nèi)源反轉(zhuǎn)錄病毒(endogenou

7、sretroviruses)的活性、甲基化外源插入DNA序列起到防御作用等。 個體在發(fā)育過程中，表觀遺傳密碼是如何建立并隨著發(fā)育的過程中按程序化重構(gòu)至今仍是個迷。研究發(fā)現(xiàn)siRNA在這個過程中發(fā)揮了重要的作用，其中siRNA指導(dǎo)的DNA甲基化是基因組表觀修飾改變的重要形式，這個過程被稱為RNA指導(dǎo)的DNA甲基化(RdDM，RNA-directedDNAmethylation)，該現(xiàn)象首先發(fā)現(xiàn)于植物系統(tǒng)中，siRNA在植物中可以

8、指導(dǎo)DNA甲基化，但在哺乳動物中卻很少報道，但是動物細(xì)胞中也存在著一些與RdDM類似的組分如DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)、Dicer蛋白等。2004年HiroakiKawasaki和KevinVMorris兩個小組分別在動物細(xì)胞中誘導(dǎo)了有意義的DNA甲基化，這些siRNA在轉(zhuǎn)錄水平抑制了靶基因的表達(dá)，這些研究工作預(yù)示在動物中也存在和植物中類似的RdDM。 siRNA研究現(xiàn)在已經(jīng)成為生命科學(xué)研究的熱點，研究發(fā)現(xiàn)siRNA廣泛參與

9、了細(xì)胞的分化發(fā)育等過程，RdDM就是siRNA參與表觀遺傳控制的一種形式，siRNA通過RdDM方式調(diào)控基因的表達(dá)，調(diào)節(jié)細(xì)胞的功能。雖然在動物細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了RdDM現(xiàn)象，但是RdDM在動物細(xì)胞中是否普遍存在，其發(fā)揮作用的機制是什么還是很模糊。為了解決這些問題，本課題擬選擇一個基因為模型研究動物細(xì)胞中的RdDM現(xiàn)象，以期探索動物細(xì)胞中RdDM的機制，以及其真實存在的證據(jù)。 DNA甲基化模式的改變是腫瘤發(fā)生中起著重要的作用，由此產(chǎn)

10、生轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默直接導(dǎo)致了抑癌基因的失活。腫瘤細(xì)胞中siRNA很可能作為信號誘導(dǎo)了抑癌基因的甲基化，從siRNA誘導(dǎo)的甲基化途經(jīng)入手，阻斷siRNA誘導(dǎo)的通路，將可能抑制抑癌基因的甲基化，也許會找出腫瘤治療的新方法，抑制腫瘤細(xì)胞中DNA異常甲基化的研究將會給腫瘤的治療研究帶來更廣闊的前景，更多的藥物和治療方法將會在這個領(lǐng)域誕生。 第一部分模式基因的選擇以及細(xì)胞模型的選擇本研究所選擇的基因應(yīng)該滿足以下條件：1，基因?qū)儆诮M織特

11、異性表達(dá)的基因；2，基因的特異性表達(dá)是受表觀遺傳因素控制。14-3-3σ基因是一種表皮組織來源細(xì)胞特異性表達(dá)的基因，但是在一些表皮組織來源的腫瘤細(xì)胞中其表達(dá)是關(guān)閉的，2000年AnneT.Ferguson小組的研究發(fā)現(xiàn)這種基因沉默是由于14-3-3σ基因啟動子區(qū)CpG島(CpGisland)的甲基化引起，所以本實驗選擇了14-3-3σ基因作為模式基因。 同樣本研究所選擇的細(xì)胞模型也應(yīng)該具備以下條件：1，陰性對照細(xì)胞，在該細(xì)胞中

12、14-3-3σ基因是不表達(dá)的；2，陽性對照細(xì)胞，該細(xì)胞中14-3-3σ基因是表達(dá)的，而且這種基因沉默或開放是由于表觀遺傳因素控制。通過RT-PCR檢測細(xì)胞cDNA的方法，檢測了多種細(xì)胞中14-3-3σ基因的表達(dá)情況，我選擇了293T和人肺癌細(xì)胞A549這兩種細(xì)胞作為細(xì)胞模型，因為14-3-3σ基因在293T細(xì)胞中不表達(dá)或者說很微弱表達(dá)，通過亞硫酸氫鹽處理測序(bisulphite-modifiedDNAsequencing)的方法證明其

13、啟動子區(qū)CpG島完全處于甲基化狀態(tài)，同樣方法證明在A549細(xì)胞中14-3-3σ基因是表達(dá)的，其啟動子區(qū)CpG島完全處于去甲基化狀態(tài)。通過免疫共沉淀后PCR的方法檢測了14-3-3σ基因CpG島區(qū)域組蛋白修飾的改變情況，檢測了組蛋白H3的乙?；癄顟B(tài)，結(jié)果顯示，在293T細(xì)胞中14-3-3σ基因CpG島區(qū)域組蛋白H3處于去乙?；癄顟B(tài)，A549細(xì)胞14-3-3σ基因CpG島區(qū)域組蛋白H3處于乙?；癄顟B(tài)。 以上實驗確定了本實驗的模式基

14、因為14-3-3σ基因，并且確定了兩種細(xì)胞模型為293T細(xì)胞和A549細(xì)胞，從而為下一步研究工作的開展奠定了基礎(chǔ)。 第二部分shRNA誘導(dǎo)14-3-3基因啟動子甲基化與基因表達(dá)沉默為了研究RdDM對14-3-3σ基因啟動子區(qū)甲基化模式以及表達(dá)的影響，本研究選擇了一段20bp的序列作為siRNA的模板，將這段siRNA設(shè)計成shRNA形式構(gòu)建入siRNA表達(dá)載體pSuppressorNeo，轉(zhuǎn)入A549細(xì)胞，G418篩選后得到A

15、549細(xì)胞shRNA穩(wěn)定篩選株(shRNA-A549)，抽取mRNA和DNA，定量PCR檢測14-3-3σ基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在A549細(xì)胞shRNA穩(wěn)定篩選株中14-3-3σ基因的表達(dá)水平與其在正常野生型A549細(xì)胞(wt-A549)中表達(dá)相比下降了50％左右；使用5-aza-dC(甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑)和TrichostatinA(TSA，組蛋白去乙酰化抑制劑)分別對A549細(xì)胞shRNA穩(wěn)定篩選株進(jìn)行處理，定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)14-3-3

16、σ的表達(dá)上調(diào)，恢復(fù)甚至超過了其在正常野生型A549細(xì)胞中的表達(dá)水平，由此可以初步確定A549細(xì)胞shRNA穩(wěn)定篩選株中14-3-3σ的表達(dá)下調(diào)是由于表觀遺傳改變而引起。 通過亞硫酸氫鹽處理后測序的方法檢測了A549細(xì)胞shRNA穩(wěn)定篩選株中14-3-3σ基因CpG島甲基化模式的改變情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)24個CpG位點中有19位點發(fā)生了重新甲基化。 通過免疫共沉淀后PCR的方法檢測了14-3-3σ基因CpG島區(qū)域組蛋白修飾的

17、改變情況，檢測了組蛋白H3的乙?；癄顟B(tài)，結(jié)果顯示A549細(xì)胞shRNA穩(wěn)定篩選株中14-3-3σ基因CpG島區(qū)域組蛋白H3發(fā)生了去乙?；淖儭?實驗中我們還設(shè)計了對照組，對照組中相對于正常A549細(xì)胞以上研究均沒有檢測到改變現(xiàn)象。 以上結(jié)果證實shRNA確實引起了14-3-3σ基因表觀遺傳修飾的改變，這種改變直接影響了14-3-3σ基因的表達(dá)，引發(fā)了基因沉默現(xiàn)象。 本課題的完成將有助于闡明動物細(xì)胞中siRN