甲狀腺乳頭狀癌低表達(dá)基因TIMP3及MLH1啟動子甲基化研究.pdf

1、目的：本課題組在前期研究中，通過蛋白表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)MGMT,基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子3（TIMP3）及 DNA錯配修復(fù)蛋白（MLH1）在甲狀腺癌中低表達(dá)，篩選出它們可能為甲狀腺癌特異性高甲基化候選基因。本研究擬選其中的TIMP3及MLH1基因，檢測兩種基因啟動子CpG島在甲狀腺乳頭狀癌組織的甲基化狀態(tài)，研究其啟動子區(qū) CpG位點(diǎn)甲基化水平與甲狀腺乳頭狀癌發(fā)生的內(nèi)在聯(lián)系。并評價TIMP3及MLH1基因啟動子甲基化作為甲狀腺乳頭狀癌分子標(biāo)志物的

2、可能性和應(yīng)用價值。
　　方法：1.收集甲狀腺乳頭狀癌,結(jié)節(jié)性甲狀腺腫患者的新鮮組織標(biāo)本，并提取其基因組DNA。2.利用甲基化引物設(shè)計軟件尋找TIMP3及MLH1基因啟動子區(qū)序列中的CpG島片段，設(shè)計并合成亞硫酸修飾測序引物(bisulfite sequencing primer，BSP)，通過 CpG島目的片段 PCR擴(kuò)增、克隆和測序，研究甲狀腺乳頭狀癌組織內(nèi)TIMP3及MLH1基因啟動子CpG片段的整體甲基化水平。3.以TIMP

3、3及MLH1基因啟動子區(qū)CpG島為目的片段，依托Sequenom MassARRAY甲基化DNA定量分析平臺，定量分析單一 CpG位點(diǎn)的甲基化水平。
　　結(jié)果：1.亞硫酸鹽修飾測序結(jié)果顯示TIMP3基因在甲狀腺癌組織中的高甲基化克隆百分比為70％，顯著高于結(jié)節(jié)性甲狀腺腫的0%(P＜0.05)。TIMP3基因啟動子在甲狀腺乳頭狀癌組織中共有12個CpG位點(diǎn)出現(xiàn)甲基化，其中5個CpG位點(diǎn)呈高度的甲狀腺乳頭狀癌特異性。MLH1基因啟動子

4、在兩種甲狀腺組織中基本沒有檢測出甲基化。2.分析Sequenom MassArray提供的單一CpG位點(diǎn)甲基化定量數(shù)據(jù)，顯示TIMP3基因在甲狀腺乳頭狀癌組織的甲基化率均值（0.28）與結(jié)節(jié)性甲狀腺腫的甲基化率均值（0.15）有顯著的差異（P﹤0.05）。MLH1基因在甲狀腺乳頭狀癌組織中的甲基化率均值（0.20）與結(jié)節(jié)性甲狀腺腫的甲基化率均值（0.12）有差異，但無統(tǒng)計學(xué)意義（P﹥0.05）。經(jīng) Sequenom MassArray提

5、供的單一CpG位點(diǎn)甲基化定量測試數(shù)據(jù)分析可知，TIMP3基因啟動子4個CpG位點(diǎn)在甲狀腺乳頭狀癌組織中的甲基化率均值與結(jié)節(jié)性甲狀腺腫相比有顯著差異（P﹤0.05）。
　　結(jié)論：MLH1基因啟動子在兩種甲狀腺組織中基本沒有檢測出甲基化，MLH1在甲狀腺癌的低表達(dá)可能與甲基化無關(guān)。TIMP3基因啟動子在甲狀腺乳頭狀癌的甲基化程度明顯高于結(jié)節(jié)性甲狀腺腫，認(rèn)為TIMP3基因啟動子甲基化和蛋白表達(dá)缺失可能是甲狀腺癌的分子標(biāo)志物。據(jù) BSP測